特殊培养法

<font>1、二倍体细胞培养法</font>

二倍体细胞培养法与一般培养相同，关键在于传代，其传代程序为：

（1）吸除旧培养液注入另瓶中。

（2）用温BSS冲洗1次。

（3）用0.25%温胰蛋白酶消化，加入消化液量以仅覆盖细胞层即可；作用1~5分钟。

（4）待细胞附着松动、细胞质边缘卷起和间隔加大，便终止消化。为防止细胞丢失，可不必再用BSS冲洗，直接向瓶中加入培养液（新旧培养液按2：1新旧混合）。

（5）轻轻反复吹打制成单个细胞悬液。

（6）按一分为二比例接种培养。

<font>2、支持物培养法</font>

加支持物培养法与一般培养法相同，只是在培养前需在培养瓶中加入已经消毒的支持物。

（1）支持物制备：如用特氟隆薄膜，无菌条件下启封，用剪刀按需要剪成各种不同大小的块，于培养接种细胞前，先置入培养容器中即可；通常多用盖玻片做支持物，用前先要把盖片用玻璃刀切成一定形态，以便装入培养瓶中，然后按如下顺序处理：自来水浸泡24小时—96%酒精30～60 min—蒸馏水浸泡30～60 min—用干净软布擦拭干净—装入培养皿中—高压或干热灭菌备用。

（2）培养法：初代消化培养、初代组织块培养、传代培养等皆可应用加支持物培养法。接种细胞后，可在任何时间取出支持物，做各种观察或实验。

<font>3、细胞分离（克隆）培养</font>

多孔塑料培养板单细胞克隆法：

（1）消化：取健康待克隆细胞，吸出瓶内培养液，加消化液。

（2）低密度细胞悬液的制备：做克隆细胞时首先需先用消化法制备出分散成单个细胞悬液，然后稀释细胞，使之成为1~2细胞/毫升悬液，最适宜细胞密度为1~2细胞/ml培养液。

（3）接种：先用吸管轻轻吹打细胞悬液，使混悬均匀，继用加样器向塑料培养板每孔内加0.5毫升。接种时要迅速准确，争取在最短时间内加完，以免培养液蒸发，然后迅速盖好盖板，置CO2温箱培养。

（4）标记：培养6~12小时后，待细胞下沉冰贴附于培养板孔底，从温箱中取出，置倒置光显微镜台上，观察和标记下含有单个细胞的孔，置CO2温箱培养。在培养中一般无需换液，只有在细胞增长过于缓慢时才可进行换液。换液时先吸除旧培养基，但不要吸除过多，余少许，以免细胞干涸。然后再迅速补加新鲜克隆培养液，继续培养3~4周。待孔内细胞增至500~600个时，可进行分离培养。