原理
TNF-α受体广泛地分布于多种肿瘤细胞和血细胞，根据TNF-α与相应靶细胞结合后引起不同的生物学效应，建立了多种检测TNF-α生物学活性方法。某些肿瘤细胞膜表面的TNF-α受体与TNF-α结合后，可导致这些肿瘤细胞的死亡，可通过检测对肿瘤细胞的杀伤能力，来反映TNF-α的生物学活性。若这种肿瘤细胞先用3HTdR标记，则被杀伤后3H-TdR释放至细胞外，通过测定肿瘤细胞释放3H-TdR的量来反映TNF-α的杀伤活性。
材料与仪器
L929 rTNF-α
放线菌素 DNA酶 胰蛋白酶 RPMI1640 3H-TdR PPO POPOP 二甲苯
滤纸 培养板 吸管 滴管 试管 加样器 CO2培养箱 显微镜 超净台
放线菌素 DNA酶 胰蛋白酶 RPMI1640 3H-TdR PPO POPOP 二甲苯
滤纸 培养板 吸管 滴管 试管 加样器 CO2培养箱 显微镜 超净台
步骤
1. 0.25 ％胰蛋白酶消化处于对数生长期的L929细胞
8. 加入放线菌素D，使放线菌素D最终浓度至1 μg/ml，用时设放线菌素、完全培基阴性对照和rTNF-α标准品阳性对照，37 ℃，5 ％CO2培养中24 h
9. 加入3 ％胰蛋白酶和0.25 ％DNA酶各10 μl/孔，37 ℃，30 min
10. 用DYQ-Ⅱ型多头细胞收集器收集样品于"9999"型玻璃纤维滤纸上
12. 结果判定
（1）TNF-α作用24 h后，在倒置显微镜下判定50 ％L929细胞杀伤的稀释度即为1个TNF-α活性单位。
（2）根据测得的cpm值按下列公式计数活性单位
2. 用RPMI1640洗涤细胞后，调整细胞浓度至2×106 /ml
3. 加入3H-TdR，20 μci/ml
4. 置37 ℃，5 ％CO2培养箱中2～3 h，摇动1 次/30 min
5. 用RPMI1640洗涤2次，800 rpm×5 min/次
6. 调整细胞浓度至2～3×105 /ml后，加入96孔培养板中，100 μl/孔
7. 加入不同稀释度的待测样本（设三个重复孔）
8. 加入放线菌素D，使放线菌素D最终浓度至1 μg/ml，用时设放线菌素、完全培基阴性对照和rTNF-α标准品阳性对照，37 ℃，5 ％CO2培养中24 h
9. 加入3 ％胰蛋白酶和0.25 ％DNA酶各10 μl/孔，37 ℃，30 min
10. 用DYQ-Ⅱ型多头细胞收集器收集样品于"9999"型玻璃纤维滤纸上
11. 烤干后，进行β计数
12. 结果判定
（1）TNF-α作用24 h后，在倒置显微镜下判定50 ％L929细胞杀伤的稀释度即为1个TNF-α活性单位。
（2）根据测得的cpm值按下列公式计数活性单位
放线菌素D对照组cpm-实验组cpm
TNF-α活性单位（U/ml）＝──────────×标准品活性单位×待测样品稀释倍数
TNF-α活性单位（U/ml）＝──────────×标准品活性单位×待测样品稀释倍数
放线菌素D对照组cpm-标准品cpm
注意事项
1. 用于标记3H-TdR的L929细胞要处于对数生长期，否则3H-TdR掺入率低，影响实验结果。
2. 标记后的L929细胞应充分洗涤，以洗掉游离的3H-TdR，则会影响完全培基对照组cpm值。
3. 胰蛋白酶和DNA酶浓度和消化时间要严格控制，酶均要摸索最适浓度和时间。否则，消化时间过长或过短者会影响实验结果。
4. 为了增强检测系统的敏感性，在测定系统中加入放线菌素D，但浓度不宜过大，一般最终浓度为0.5～1 μg/ml。
5. 在测定PHA等丝裂原诱导的PBMC培养上清时，要注意排除TNF-β（淋巴毒素）的影响。因为TNF-β细胞毒生物学作用等很多生物学效应均与TNF-α相似。
2. 标记后的L929细胞应充分洗涤，以洗掉游离的3H-TdR，则会影响完全培基对照组cpm值。
3. 胰蛋白酶和DNA酶浓度和消化时间要严格控制，酶均要摸索最适浓度和时间。否则，消化时间过长或过短者会影响实验结果。
4. 为了增强检测系统的敏感性，在测定系统中加入放线菌素D，但浓度不宜过大，一般最终浓度为0.5～1 μg/ml。
5. 在测定PHA等丝裂原诱导的PBMC培养上清时，要注意排除TNF-β（淋巴毒素）的影响。因为TNF-β细胞毒生物学作用等很多生物学效应均与TNF-α相似。
来源：丁香实验
