干扰素(IFN)生物学活性检测
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(一)原理
干扰素能刺激某些指示细胞(如人羊膜上皮细胞Wish株、人喉癌细胞株Hep-2以及人胚肌皮或肺单层细胞)产生抗病毒蛋白,从而使细胞免受水疱性口炎病毒(VSV)的攻击,根据待测样品不同稀释度的保护能力,计算出干扰素生物学活性单位。
(二) 操作步骤
96孔培养板中加入不同稀释度的IFN和标准IFN,
每个稀释度设3孔,每孔50μl,病毒对照不加IFN
↓
每孔加入100μl 1.5~2×105/ ml Wish
或Hep-2细胞悬液,37℃、CO孵箱培养6~12h,
使细胞贴壁为单层
↓
每孔加入50μl含100个 TCID50 VSV,
细胞对照不加病毒液
↓
根据细胞病变状态,终止培养前3~4h
加入5mg/ml MTT, 15μL/孔
↓
加入适量生理盐水,用滴管轻轻吹吸
弃去悬浮病变细胞和死细胞
↓
200μl/孔 二甲亚砜(DMSO),作用10min
↓
测OD(570nm),表示活细胞中含甲 的量,
也可用刚果红摄入法、结晶紫染色法
测定IFN对活细胞的保护水平
计算:
以保护半数(50%)细胞免受病毒损害的最高干扰素稀释度为1个干扰素活性单位。也可从标准曲线中求得待测样品的IFN活性单位。
(三) 试剂 和器材
1. VSV
2. WISH、HeP-2细胞株或人胚肌皮或肺单层培养物。
3. MTT[3-(4,5二甲噻唑-2-yl)-2,5-2苯基-四唑溴盐],二甲亚砜(DMSO),刚果红,结晶紫等。
4. 10%FCS RPMI1640, 培养板、 培养瓶 、CO孵箱、超净台、酶联检测仪。
(四) 注意事项
1. 实验时先加IFN,后加指示细胞,以使细胞均匀分布于培养板底部。
2. 本法对天然培养上清或重组IFN-α、IFN-β和IFN-γ均可检测其活性单位。
干扰素能刺激某些指示细胞(如人羊膜上皮细胞Wish株、人喉癌细胞株Hep-2以及人胚肌皮或肺单层细胞)产生抗病毒蛋白,从而使细胞免受水疱性口炎病毒(VSV)的攻击,根据待测样品不同稀释度的保护能力,计算出干扰素生物学活性单位。
(二) 操作步骤
96孔培养板中加入不同稀释度的IFN和标准IFN,
每个稀释度设3孔,每孔50μl,病毒对照不加IFN
↓
每孔加入100μl 1.5~2×105/ ml Wish
或Hep-2细胞悬液,37℃、CO孵箱培养6~12h,
使细胞贴壁为单层
↓
每孔加入50μl含100个 TCID50 VSV,
细胞对照不加病毒液
↓
根据细胞病变状态,终止培养前3~4h
加入5mg/ml MTT, 15μL/孔
↓
加入适量生理盐水,用滴管轻轻吹吸
弃去悬浮病变细胞和死细胞
↓
200μl/孔 二甲亚砜(DMSO),作用10min
↓
测OD(570nm),表示活细胞中含甲 的量,
也可用刚果红摄入法、结晶紫染色法
测定IFN对活细胞的保护水平
计算:
以保护半数(50%)细胞免受病毒损害的最高干扰素稀释度为1个干扰素活性单位。也可从标准曲线中求得待测样品的IFN活性单位。
(三) 试剂 和器材
1. VSV
2. WISH、HeP-2细胞株或人胚肌皮或肺单层培养物。
3. MTT[3-(4,5二甲噻唑-2-yl)-2,5-2苯基-四唑溴盐],二甲亚砜(DMSO),刚果红,结晶紫等。
4. 10%FCS RPMI1640, 培养板、 培养瓶 、CO孵箱、超净台、酶联检测仪。
(四) 注意事项
1. 实验时先加IFN,后加指示细胞,以使细胞均匀分布于培养板底部。
2. 本法对天然培养上清或重组IFN-α、IFN-β和IFN-γ均可检测其活性单位。