肿瘤坏死因子-α(TNF-α)生物学活性测定

　　肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一种主要由单核-吞噬细胞产生的单核因子，不仅具有选择性地杀伤某些肿瘤细胞，而且有多种免疫调节作用。其检测方法主要包括生物学活性测定和免疫学检测方法。其中细胞毒生物学检测方法敏感性较高，最为常用；免疫学检测方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)和放射免疫测定法。
　　(一)　原理:
　　TNF-α受体广泛地分布于多种肿瘤细胞和血细胞，根据TNF-α与相应靶细胞结合后引起不同的生物学效应，建立了多种检测TNF-α生物学活性方法。某些肿瘤细胞膜表面的TNF-α受体与TNF-α结合后，可导致这些肿瘤细胞的死亡，可通过检测对肿瘤细胞的杀伤能力，来反映TNF-α的生物学活性。若这种肿瘤细胞先用3H-TdR标记，则被杀伤后３H-TdR释放至细胞外，牽I通过测定肿瘤细胞释放３H-TdR的量来反映TNF-α的杀伤活性。
　　(二)　操作步骤:
　　　　　　　0.25％胰蛋白酶消化处于对数生长期的L929细胞
　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　用RPMI1640洗涤细胞后，调整细胞浓度至2×10６／ml
　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　　　　加入３H-TdR，20μci／ml
　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　　置37℃，5％CO培养箱中2～3h，摇动1次／30min
　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　　用RPMI1640洗涤2次，800rpm×5min／次
　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　　调整细胞浓度至2～3×10５／ml后，加入96孔
　　　　　　　　　培养板中，100μl／孔
　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　　加入不同稀释度的待测样本(设三个重复孔)
　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　　加入放线菌素D，使放线菌素D最终浓度至1μg／ml
　　　　　　　　　用时设放线菌素、完全培基阴性对照和rTNF-α标准
　　　　　　　　　　　　　　　　品阳性对照
　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓37℃, 5％CO培养中24h
　　　　　　　　　　　　加入3％胰蛋白酶和0.25％DNA酶各10μl／孔
　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓37℃，30min
　　　　　　　　　　　　用DYQ-Ⅱ型多头细胞收集器收集样品于
　　　　　　　　　　　　"9999"型玻璃纤维滤纸上
　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　　　　　　　烤干后，进行β计数

　结果判定:  免疫学实验技术论坛   http://bbs.bbioo.com/forum-140-1.html
　　1.　TNF-α作用24h后，在倒置显微镜下判定50％L929细胞杀伤的稀释度即为１个TNF-α活性单位。
　　2.　根据测得的cpm值按下列公式计数活性单位:
　　　　TNF-α活性单位(U／ml)
　　　　　　　　放线菌素D对照组cpm-实验组cpm
　　　　　　　＝──────────────×标准品活性单位×待测样品稀释倍数
　　　　　　　　放线菌素D对照组cpm-标准品cpm
　　(三)　 试剂 和器材:
　　1.　鼠成纤维细胞(L929)
　　2.　rTNF-α和待测样品
　　3.　放线菌素、DNA酶、胰蛋白酶
　　4.　10％FCS RPMI1640，RPMI1640
　　5.　３H-TdR，PPO，POPOP、二甲苯，玻璃纤维滤纸
　　6.　96孔培养板、无菌吸管、滴管、试管、加样器和加样器头
　　7.　CO培养箱、倒置显微镜、超净台等
　　(四)　注意事项:
　　1.　用于标记３H-TdR的L929细胞要处于对数生长期，否则３H-TdR掺入率低，影响实验结果。
　　2.　标记后的L929细胞应充分洗涤，以洗掉游离的３H-TdR，牱q则会影响完全培基对照组cpm值。
　　3.　胰蛋白酶和DNA酶浓度和消化时间要严格控制，犆?批酶均要摸索最适浓度和时间。否则，消化时间过长或过短者会影响实验结果。
　　4.　为了增强检测系统的敏感性，在测定系统中加入放线菌素D，但浓度不宜过大，一般最终浓度为0.5～1μg／ml。
　　5.　在测定PHA等丝裂原诱导的PBMC培养上清时，要注意排除TNF-β(淋巴毒素)的影响。因为TNF-β细胞毒 生物 学作用等很多 生物 学效应均与TNF-α相似。