抗体纯化实验

实验分类：

免疫学实验

最新修订时间：2023-05-06

简介

抗体纯化实验是用于纯化免疫血清中的抗体。目前，用于抗体纯化的方法主要有 6 种：盐析法、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析和高效液相色谱。

原理

盐析法提纯抗体的基本原理是在蛋白质溶液中加入大量的中性盐（如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）以破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出，沉淀不同蛋白质所需盐浓度及 pH 值不同。

凝胶柱层析法提纯抗体的基本原理是凝胶本身是一种多孔网状结构分子筛，其线性基质含多个羟基，具有亲水性，在交联剂作用下交联形成不溶于水的三维空间网络结构，常用葡聚糖（sephadex）或琼脂糖（sepharose）类物质。

当蛋白质溶液流经凝胶柱时，大分子蛋白质不能穿过凝胶网孔进入凝胶粒内部，因此留在胶粒间隙的溶液中，随洗脱液最先流出。而小分子蛋白质则进入胶粒内部，由于受到胶粒阻留，流速较慢，即可根据蛋白质分子量大小不同，将蛋白质组分由大到小依次分离出来（图 1-1）

来源：丁香实验团队

操作方法

盐析法提纯抗体

盐析法提纯抗体是在蛋白质溶液中加入大量的中性盐破坏蛋白质周围亲水基团与水形成的水化膜及其所带电荷的稳定使抗体析出。

凝胶柱层析法提纯抗体

凝胶柱层析法也称分子筛层析、排阻层析，是根据蛋白质分子量大小不同，将蛋白质组分由大到小依次分离出来。

🔥 利用免疫印迹法（WB）进行抗体纯化

利用 western blot 进行抗体纯化的步骤如下：1、上样蛋白准备。将免疫抗原作为上样蛋白进行备样，设置 3 个不同浓度的上样量（2 ug、4 ug、6 ug），以便后续可通过不同量的蛋白泳道孵育出的深浅不同验证抗体特异性。2、点样及电泳。根据免疫抗原的分子量大小配置适合的电泳胶（8%～15%），以能明确看到免疫抗原位置为准，进行电泳。120 V 恒压，90～120 min 至蓝色指示带跑到