简介
凝胶柱层析法也称分子筛层析、排阻层析，是根据蛋白质分子量大小不同，将蛋白质组分由大到小依次分离出来。
材料与仪器
器材：层析仪 1 套；2.5x100 cm 层析柱；滤网（滤纸）；1000 ml 烧杯；5 ml 吸量管；试管。
试剂：
① 0.05mol/L pH8.0 磷酸缓冲液（PB）：0.2mol/L Na2HPO4 溶液 94.7 ml，0.2mol/L NaH2PO4 溶液 5.3 ml 混合后，蒸馏水稀释至 400 ml；
② Sephadex G-200 干胶 20 g；
步骤
凝胶柱层析法提纯抗体的基本过程可分为如下几步：
A 凝胶处理：Sephadex G-200 使用前应用水充分膨胀，一般需膨胀 72 小时。为节约时间，也可煮沸 2-4 小时，并重复漂洗 2-3 次。
B 装柱：柱内径和高度之比为 1：20-1：50 范围的层析柱，与蠕动泵、紫外监测仪相连，并向柱内加入 1/3 高度的缓冲液，将溶胀的 Sephadex G-200 凝胶用缓冲液调成糊状，沿柱内壁填充到柱内，待其部分自然沉降后，吸出部分上清，再加入凝胶，反复数次，直至凝胶距柱上口 6-8 cm，在凝胶上放一直径略小于柱内径的圆形滤纸片，使其平铺在凝胶柱面上。
目的是避免加样或加缓冲液时破坏凝胶柱界面的平整，并能防止样品中的颗粒进入凝胶柱。按 0.2 ml/min 流速，连续冲洗，使柱充分平衡后上样，Sephadex G-200 柱一般需平衡 4 小时以上。
C 加样：吸去滤纸片上层缓冲液，加入 2 ml 经饱和硫酸铵沉淀的抗体样品，待样品完全进人层析凝胶柱后，再加满洗脱缓冲液。
D 洗脱：用 0.05mol/L pH8.0 磷酸缓冲液，以 0.1 ml/min 速度洗脱，记录洗脱图谱，分步收集洗脱组分（2 ml/管）。
E 检测：收集的样品采用紫外分光光度计法检测蛋白含量，蛋白主峰为 IgG，可进一步检测 IgG 免疫学活性和纯度。
注意事项
1、装柱过程切忌有气泡和断层，若有断层，需倾倒出填料，重新装柱。
2、加样时，注意缓冲液界面恰好在滤纸片上，及时加样，不能出现因放液过快使凝胶柱干涸现象，否则凝胶不能继续使用。
3、整个层析过程时间较长，要求在 4℃ 环境中操作，以防蛋白活性下降。
来源：丁香实验
