盐析法提纯抗体

器材：磁力搅拌器，低温冰箱，4℃ 离心机，电子天称，紫外分光光度计，烧杯，透析袋，精密 pH 试纸（pH5.5-9.0），转子，离心管，移液器。

试剂：

①饱和硫酸铵溶液：称取 400-425 g 分析纯 (NH₄)₂SO₄，以 80-100℃ 双蒸水 500 ml 溶解（表 1-2），磁力搅拌器充分搅拌直至所加入的硫酸铵全部溶解，趁热过滤，滤纸可用 125μm 规格。冷却后以浓氨水（15mol/L NH₂OH）调 pH 值至 7.4。配制好的饱和硫酸铵，瓶底应有大量结晶析出，保存于室温；

②0.9％ 氯化钠溶液（生理盐水）；

③0.15mol/L、pH7.4 磷酸缓冲盐液（phosphate buffered saline，PBS）：称取 8 g NaCl，0.2 g KCl，2.9 g Na₂ HPO₄•112 H₂0，0.2 g KH₂PO₄ 溶于 1000 ml 双蒸水 中，用 HCl 调 pH 至 7.4，保存于室温；

④萘氏试剂：称取 11.5 g HgI₂，8 g KI，加双蒸水至 50 ml，搅拌溶解后，再加入 20％NaOH 50 ml

盐析法提纯抗体的基本过程可分为如下几步：

A 收集的血液装于适当容器并置 37℃ 温箱 1 小时，再置 4℃ 冰箱过夜，待血液凝固血块收缩后，吸出血清，以 4000r/min 离心 15 分钟，取上清，加入防腐剂（终浓度 0.01％ 硫柳汞或 0.02％ 叠氮钠），或加入等量中性甘油，分装后置-20℃ 或-80℃ 冰箱中保存备用。

注意事项：抗体应避免反复冻融，效价可保持 2 年以上。也可将抗血清冷冻干燥后长期保存，但在干燥过程中抗体效价可能会丢失一部分。

B 10 ml 免疫血清加等量生理盐水稀释，混匀后置磁力搅拌器上，边搅拌边逐滴加入 20 ml 饱和硫酸铵，使其终浓度为 50％。4℃ 放置 2 小时以上，使其充分沉淀。

C 4000r/min，4℃ 离心 30 分钟，弃上清。以 20 ml 生理盐水溶解沉淀，然后加入 10 ml 饱和硫酸铵，使其终浓度为 33％，4℃ 放置 2 小时以上。

D 重复上述第二步过程 2 次。将末次离心所得沉淀物以 4 ml 0.15mol/L pH7.4 PBS 溶解后，装入透析袋。

E 将透析袋放入 50-100 倍体积的 PBS 中，4℃ 充分透析除盐，期间至少换液 3 次以上，至萘氏试剂测透析外液无黄色。也可采用 Sephadex G-25 层析除盐，该法除盐较彻底、快速，但抗体浓度将被稀释。

F 取少量透析后样品适当稀释后，以紫外分光光度计检测蛋白含量，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测抗体纯度。蛋白含量还可通过如下公式进行计算：

蛋白含量（mg/ml）＝（1.45xOD280 mm-0.74x OD260 mm）x 样品稀释度。

＊注：计算公式中 1.45 与 0.74 为常数，nm 为波长。

E 分装抗体，置于-20℃ 或-80℃ 冰箱保存。

1. 全部实验应在 20℃ 以下环境中进行，有些环节需在 4℃ 操作，如离心和透析过程，以防免疫球蛋白（Ig）变性和降解，确保抗体的活性。

2. 血清需稀释后再盐析，饱和硫酸铵加入应缓慢，均可避免杂质与抗体发生共沉淀，影响纯化抗体的纯度。

3. 蛋白质沉淀后宜在 4℃ 放置 2 小时以上或过夜，以形成较大沉淀而易于分离。

4. 溶液中的离子强度直接影响蛋白质的稳定性，不同蛋白发生沉淀的离子强度不同。因此，当硫酸铵的饱和度不同，从免疫血清中析出的蛋白成分就不同。如果盐析的免疫球蛋白来源于小鼠，则饱和硫酸铵终浓度以 45％-50％ 为宜，过低会导致抗体的丢失，当饱和度为 33％ 时 γ 球蛋白析出；当饱和度大于 50％ 时，白蛋白及大多数拟球蛋白析出。