DNA基础知识

一、材料 1. 缓冲液、溶液和试剂 高严格性洗涤缓冲液（0.2XSSC，5 g/LSDS），预热到 68°C(可选，见第 9 步） 低严格性洗涤缓冲液（2XSSC，5 g/LSDS)，预热到 68°C(可选，见第 9 步） SDS，5 g/L(可选，见第 9 步） SSC，20X（1L 配方：175.3 gNaCl 和 88.2 g 柠檬酸钠,pH7.0) 2. 核酸和寡核苷酸 Bl

分子杂交是核酸链以碱基配对规则的一种结合方式，是核酸的重要理化特性。利用分子杂交这一特性来对特定核酸序列进行检测，必须将杂交链中的一条用某种可以检测的进行标记，这条链就称为核酸探针。因此，核酸探针的制备是分子杂交技术的关键。放射性同位素标记是最早采用的也是目前最常用的核酸探针标记方法。

反向 PCR 又称染色体缓移或染色体步移，可对未知序列扩增后进行分析，探索邻接已知 DNA 片段的序列，并可将仅知部分序列的全长 cDNA 进行分子克隆，建立全长的 DNA 探针。反向 PCR 可用于研究与已知 DNA 区段相连接的未知染色体序列。方法原理反向 PCR 的基本原理是选择的引物虽然与核心 DNA 区两末端序列互补，但两引物 3 ’端是相互反向的。扩增前先用限制性内切酶酶切样品 DNA

一、预杂交 1. 试剂与配制 2×SSC 50%去离子甲酰胺：用4×SSC配制（v/v） 预杂交液：2×SSC，5%硫酸葡聚糖，50%甲酰胺，0.2%脱脂奶粉 2. 操作方法 （1）在进行完原位PCR扩增后，用2×SSC预浸经乙醇脱水、空气干燥的玻片，并简洗15 min； （2） 用50%去离子甲酰胺37℃孵育15

这种 PCR-SDM 方法的要点包括如下几个方面。1. 使用的模板浓度有所增加，这样就可以减少循环数，因此减少了非特异产物扩增的可能性。2. 加入了 Taq Extender, 扩增较长的 PCR 产物时产量和可靠性都有所提高。3. 使用 Dpm I 限制性内切酶，降低了母本分子的数量。4. 使用 Pfu DNA 聚合酶除去延伸出的碱基，提高了平末端连接的效率。

实验目的学习和掌握限制性内切酶的特性掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法并理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具。相关基础知识限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。它是基因工程中用于体外剪切基因片段的重要工具酶。上世纪七十年代，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌

1、细胞分盘：通过胰酶消化收集细胞，用适当的完全培养基以 4×105 至 8×105 细胞/cm2 的密度平铺细胞于 60 mm 组织培养皿上（根据实验需要选择培养皿，使细胞贴壁后所占总面积达到培养皿面积的 70~90％）。根据细胞贴壁情况于含 5％ CO2 的 37 ℃ 温箱中孵育 8~24 h，当细胞贴壁完全后即可开始转染。转染前换入 2 mL 预热的无血清培养基。2、制备 PEI-DNA 混

细胞计数法是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种方法。一般利用计数板（血球计数板）进行。即可用于分离（散）细胞培养接种前计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，也可用于对培养物的细胞数量进行计数。不论计数的对象如何，均须制备分散的细胞悬液。

DAPI的配制及贮存固体粉末 ：避光，2-8 ℃保存，3年没有问题。贮存液 ：用无菌水配制成浓度1 mg/ml 的贮存液，配好后用锡纸包起来，避光，可在-20 ℃下长期保存。（DAPI易溶于水，在PBS中溶解度不高）使用浓度 ：贮存液用1xPBS稀释到终浓度100 ng/ml。荧光封片液 ：0.5 mol/L碳酸盐缓冲液与甘油等体积混合，pH9.5染色与观察 ：制好的玻片上滴加几滴DAPI染液，染