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全血 RNA 提取实验

全血RNA的提取可用于：（1）研究RNA干扰机制等；（2）用作反转录模板；（3）分子生物学其他研究。

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RNA 干扰技术

转录后基因沉默机制（post-transcriptional gene silencing，PTGS）被称为RNA干扰（RNAi），与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链 RNA（dsRNA）导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。目前为止较为常用的制备 siRNA的方法有化学合成、体外转录、长片段dsR-NA经RNA酶I类降解（如Dicer，E.coli的RNA酶II）体外制备 siRNA，以及通过 siRNA 表达载体或者病毒载体、PCR制备的siRNA

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RNA干扰技术

操作方法所属实验：RNA 干扰技术

RNA干扰

1. 病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应。其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21-23 bp），即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。2. RNAi具有的特征①RNAi是转录后水平的基因沉默机制；②RNAi具有很高的特异性，只降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA；③RNAi抑制基因表达具有很高的效率，表型可以达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的dsRNA分子（数量远远少于内源mRNA的数量）就能完全抑制相应基因的表达，是以催化放大的方式进行的；④RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点；⑤dsRNA不得短于21个碱基，并且长链dsRNA也在细胞内被Dicer酶切割为21 bp左右的siRNA，并由siRNA来介导mRNA切割。而且大于30 bp的dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰，而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡；⑥ATP依赖性：在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低或消失显示RNA干扰是一个ATP依赖的过程。可能是Dicer和RISC的酶切反应必须由ATP提供能量。3. 也有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt长的片段，这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化，从而使启动子失去功能，使其下游基因沉默。

操作方法所属实验：RNA 干扰（转录后基因沉默）实验

问RNA干扰技术温度如何控制？

Kimser

在PCR仪上进行两步扩增反应：94℃和72℃。 PCR产物的纯化是4℃。

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问RNA干扰和活体观察FRET可以结合么？

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【资源】RNA干扰

RNA干扰 RNA干扰（RNA interference，缩写为RNAi）是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默。RNAi在基因沉默(silent gene)方面具有高效性和简单性，所以是基因功能研究的重要工具。 siRNA是一类长约21～25 个核苷酸的双链小RNA分子，可作为一种特殊引物,在RNA 依赖RNA聚合

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RNA干扰靶序列设计

相关专题慢病毒包装技术专题 RNA干扰靶序列设计的方法最初由Elbashir et.al 2001发表。之后由于发现了RISC与siRNA结合的偏好，设计干扰效果优秀的siRNA的成功率大大增加。我们主要采用Pei and Tuschl(N2[CG]N8[AUT]N8[AUT]N2)发表的设计原则进行设计。对初步筛选出的所有符合条件的序列进行siRNA正义和反义链自由能计算，评估对RISC的亲和力。评估通过的siRNA进一步

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真菌 RNA 提取实验

真菌RNA的提取可以：（1）用于真菌RNA干扰机制研究；（2）用于cDNA文库构建等研究；（3）用于真菌分子生物学相应研究。

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细胞转染

细胞转染可应用于：（1）真核细胞可以掺入外源DNA而获得新的遗传标志；（2）转基因动植物；（3）生物制药、基因治疗、RNA干扰。

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工具药、融合蛋白等示踪自噬形成

抑制剂6.Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂二、自噬抑制剂1.3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制剂2.Bafilomycin A1：质子泵抑制剂3.Hydroxychloroquine（羟氯喹）：Lysosomal lumen alkalizer（溶酶体腔碱化剂）除了选用上述工具药外，一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预：包括反义RNA干扰技术（Knockdown）、突变株筛选、外源基因导入等。

操作方法所属实验：细胞自噬过程的观察和检测方法

问胚胎 RNA干扰是用 shRNA 还是慢病毒？大概什么时期注射？

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问RNA干扰技术有什么缺点

上海欧易

RNA 干扰（RNA interference，RNAi）技术利用双链RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型，是进行分子机制实验中最常用的实验技术。目前，RNA干扰方式主要集中在两方面：化学合成的siRNAs和Vector-based shRNA。对于siRNA，其通常直接使用化学合成并转染细胞，缺点是稳定性较低，作用时间也较短；对于shRNA，其有两种导入细胞的方式，一种是通过构建质粒载体，一种是通过病毒转染，相对操作更复杂，但作用时间更长。

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RNA干扰靶序列设计

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shRNA文库：RNA干扰研究者的福音

A resource for large-scale RNA-interference-based screens in mammals PATRICK J. PADDISON1,*, JOSE M. SILVA1,*, DOUGLAS S. CONKLIN1,*,?, MIKE SCHLABACH2,?, MAMIE LI2, SHOLA ARULEBA1, VIVEKANAND BALIJA1, ANDY O'SHAUGHNESSY1, LIDIA GNOJ1, KIM

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研发表达 SiRNA 的慢病毒载体实验

本章描述了如何使用慢病毒载体传递小干扰RNA (siR N A )介导的沉默盒。这两种技术的结合发展成为体内外长期降低特定靶标基因表达的强大工具。它结合了 RNA干扰的特异性和慢病毒载体的多功能性，可以转染多种类型的细胞。作者：T.弗里德曼等,译者：殷勤伟等，本实验来自「基因转移」

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问RNA干扰技术可以用在哪些领域？

小布丁瑶瑶

RNA干扰技术可以用于包括鉴定基因功能、疾病治疗、植物病毒抗性研究在内的多项研究领域。

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问RNA干扰提取RNA注意事项？

迟C迟

① 使用无 RNase 的塑料制品和枪头，玻璃器皿要消毒，避免交叉污染；使用性能较好的移液器，如 Eppendorf、Thermo 等；② DEPC 有剧毒，小心配制；配制溶液应使用无 RNase 的水；③ 操作人员应戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套；④ 样品应避免反复冻融，否则影响提取 RNA 提取得率和质量；⑤ 若下游实验对 DNA 非常敏感，可用不含 RNase 的 DNase I 对 RNA 进行处理。

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有望用于治疗SARS的新技术：RNA干扰

RNA干扰（RNA ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）是一种由双链RNA诱发的基因沉默（ｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）。在此过程中，与双链RNA有同源序列的信使RNA（ｍRNA）被降解，从而抑制了该基因的表达。RNA干扰技术在探查基因功能和治疗人类疾病方面有广阔的应用前景。国内已有研究机构将该技术用于ＳＡＲＳ治疗的攻关研究。本文简要介绍RNA干扰的研究历史、作用机制和应用。人们对RNA干扰的认识来源于用蠕虫

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RNA干扰的起源

相关专题 RNA干扰技术首次发现dsRNA能够导致基因沉默的线索来源于线虫Caenorhabditis elegans的研究。 lang=EN-US>1995年，康乃尔大学的Su Guo博士和 lang=EN-US>Kemphues在试图阻断秀丽新小杆线虫(C. elegans)中的par-1基因时，发现了一个意想不到的现象。她们本是利用反义RNA技术特异性地阻断上述基因的表达，而同时在对照实验中给线虫注射正义RNA(sense

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