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焦磷酸测序 (pyrosequencing) 是一种基于发光法测定焦磷酸 (PPi) 的测序技术。焦磷酸测序技术的三个关键点分别是：①反应中使用 dATP 的类似物 dATPaS，因为 dATP 的结构与 ATP 相似，能与荧光素反应发出荧光，而 dATPαS 几乎不产生背景荧光。②反应中三磷酸腺苷双磷酸酶使测序能循环进行，因为每加一种 dNTP 时必须除去上一次未反应的 dNTP，否则会影响连续测序。这种双磷酸酶能够在聚合反应完成后降解剩余的 dNTP，因此无需用分离或洗涤步骤来除去剩余

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乳化液PCR实验

2005 年，Margulies 等人在「Nature」上发表文章介绍了一种快速简单的测序方法：即以 DNA 扩增的乳胶系统 (emulsion system) 和皮升大小焦磷酸 (pyrophosphate) 为基础的测序方法——焦磷酸测序 (pyrosequencing) 方法。这种测序方法比传统的 Sanger 测序的方法快 100 倍, 假如利用这种方法来进行人类基因组的测序，那么在 100 多天内就可以完成。在 2005 年年底， 454 公司的研究人员将这种崭新的测序

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焦磷酸测序

操作方法所属实验：焦磷酸测序

焦磷酸测序法

操作方法所属实验：焦磷酸测序（Pyrosequencing）实验方法及技术

问RT-PCR 没有产物是为什么？

我是金博士

到0.4 μg/μl）以帮助小量样品RNA的恢复。逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，spermidine，甲酰胺和胍盐。将对照RNA同样品混合，同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。3）多糖同RNA共沉淀建议解决方法：使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。4）用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火建议解决方法：确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。对于基因特异性引物（GSP），可以试一下其他GSP，或换用oligo(dT)或随机六聚体.确定

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焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术(多图)

焦磷酸测序（Pyrosequencing）技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，操作极为简便。Pyrosequencing技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP,若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团（PPi）。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP,继续

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焦磷酸测序（Pyrosequencing）实验方法及技术

先进的基于焦磷酸测序（Pyrosequencing）的PSQ96 MA技术平台，能提供基于序列测定的SNP检测、等位基因频率分析和甲基化检测服务。另外，还提供短片段的测序服务（50-100 bp），适用于细菌和病毒分型等研究领域。基于Pyrosequencing的SNP分析具有快速、高通量的特点，完成96个样品的SNP分析仅需10分钟。整个实验过程（包括PCR扩增、单链分离、Pyrosequencing测序和数据分析）也只需3-4 小时。 PSQ

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🔥 恒温扩增技术

环介导恒温扩增是指在 60~65 ℃ 等温环境下，DNA 处于动态平衡状态，在此温度下利用 4 种特异引物依靠一种高活性链置换 DNA 聚合酶，使 DNA 在短时间内进行核酸扩增的技术。反应能产生大量的扩增产物即焦磷酸镁白色沉淀，可以通过肉眼观察白色沉淀的有无来判断靶基因是否存在。

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测序酶进行标记测序反应

上下抽吸轻轻混匀（避免产生气泡），于37℃温育30 min，然后在此退火温度下放置直至进行步骤3。 3. 当引物正和模板退火时，对应每个待测模板，分别标记好A、C、G、T 4个微量离心管。 DNA测序用酶的特性 3. 分别加入2.5 μl A、C、G、T 测序酶终止混合液至A、C、G、T管的底部4. 在临用前，才用测序酶稀释液稀释测序酶/焦磷酸酶混合物至1~ 2 U 测序酶/μl，置于冰浴。 5. 将下列试剂加入已退火的引物和模板中（1）2 μl 标记混合物（2）0.5~1.5 μl 10

操作方法所属实验：双脱氧法 DNA 测序实验

用 T7 噬菌体 DNA 聚合酶进行双脱氧测序反应实验

商提供，浓度为 13u/ul(约 lmg/ml)。-20°C 储存（不要使用无霜冰箱）。酵母无机焦磷酸酶可选用，请参见步驟 6。厂商（USB/Amersham Life Science 公司）提供的酶浓度为 5u/ml，它可催化焦磷酸水解为 2 分子正磷酸盐。焦磷酸酶与测序酶以 1:3 的比例混合，最好采用等体积混合两种酶，并用 6 倍体积的酶稀释缓冲液稀释该混合钧。测序酶的工作浓度为 1.6u/ul, 同时加入足量焦磷酸酶以防止焦磷酸的积累，每个测序反应需 2ul 稀释的酶混合液。核酸和寡梭苷酸

操作方法所属实验：用 T7 噬菌体 DNA 聚合酶进行双脱氧测序反应实验

焦磷酸测序（Pyrosequencing）实验方法及技术

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焦磷酸 pyrophosphoric acid

H4 P2 O7 ，缩写为 PPi，亦称二磷酸（ diphosphoric acid）。可由水解变成正磷酸，在无机焦磷酸酶的作用下，也能产生酶促水解。是四碱基酸，与金属形成络合物的性质强，对各种金属酶起抑制作用。有些辅酶是焦磷酸酯，它和酶起作用时，需要 Hg2 等二价金属离子。在生物界，微生物、霉菌、藻类等都有发现。已知在动物的酶促反应中，是通过 ATP等的酶促水解与其它基质的相互作用生成的。例如在很多生物合成反应中，都会发生 ATP的焦磷酸分解， ATP→ AMP PPi

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基本方案

是指 pH 7.7、25℃ 时，存在 0.6 mmol/L ATP 和 0.1 mmol/L D-荧光素的条件下，每分钟能产生 1 nmol 焦磷酸的荧光素的量）。

操作方法所属实验：荧光素酶的测定实验

基本方案1 非特异酸性磷酸酶消化磷酸蛋白质

聚丙烯酰胺凝胶中电泳脱磷酸样品。放射标记的样品通过放射自显影或磷成像分析底物蛋白放射标记物的丢失；非标记样品通过免疫印溃分析底物迁移率的变动。6. 剩余的样品加入 10 μl 的 100 mmol/L 焦磷酸钠（终浓度 10 mmol/L）以终止脱磷酸反应。通过适当的蛋白质功能分析方法分析底物脱磷酸化的变化。

操作方法所属实验：酶法检测磷酸化实验

羟乙基焦磷酸硫胺素 hydroxyethylthiami-ne diphosphate

硫胺素二磷酸是作为丙酮酸脱羧反应的辅酶，它是丙酮酸的 CH3 CO基移到硫胺素二磷酸时的中间体（ R． Breslow， H． Holzer），在酮戊二酸的脱羧反应和转酮（醇）酶（ transketolase）作用下，也能形成近似的中间体。在心肌，骨骼肌中，维生素 B1 许多是以这种羟基体的形态存在的。

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【转帖】一种快速，灵敏的，经济的测序方法--焦磷酸测序介绍

往往测几十bp就可以满足需要.在这种情况下，Sanger法未必是最合适的ＤＮＡ序列分析技术。新发展的Pyrosequencing(焦磷酸测序)技术应该是目前最适合这些应用的ＤＮＡ序列分析技术。 Pyrosequencing技术是新一代DNA序列分析技术，该技术对DNA的序列分析无须进行电泳，DNA片段无须荧光标记，因此相应的仪器系统无须荧光分子的激发和检测装置.本文将就Pyrosequencing技术的原理和应用进行介绍和讨论．一、Pyrosequencing技术的原理

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多重替代扩增

多重替代扩增的基本过程可分为如下几步：（一）反应体系：基因组 DNA : l00fg—300ng；引物：50μmol/L (5』-NpNpNpNpsNps N-3』, 巯基磷酸修饰，核酸外切酶抗性)；lmmol/L dNTPs； 10 mmol/L MgCl2 ； 37 mmol/L Tris-HCl, pH7.5； 50mol/.L KC1； 5 mmol/L (NH4)2SO4; 酵母焦磷酸酶 lU/ml；φ29DNA 聚合酶 800U。（二）扩增条件 30°C孵育18 h, 扩增结束

操作方法所属实验：全基因组 PCR

基本方案直接分析

1 h。10. 在 250 ml 的 5 % TCA 中将胶浸泡 15 min，重复一次。在 500 ml 1 % 焦磷酸钠/ 5 % TCA 中洗胶，重复洗涤，直至洗液几乎不含放射性物质。11. 在滤纸上使胶干燥，放射自显影。

操作方法所属实验：凝胶中激酶直接分析实验

焦磷酸酶 pyrophosphatase

磷酸酶的一种。是催化焦磷酸水解为正磷酸的酶之总称。EC 3． 6． 1． 1．仿照磷酸单酯酶，根据最适 pH可分为三种情况：（ 1）在最适 pH为 7.2-7.8，可通过 Mg2 而被活化，含于动物组织和酵母中；（ 2）最适 pH5.0-5.5，含于肝脏、肾脏、霉菌和植物的种子中不为金属盐所活化，可因氟化物而受阻抑；（ 3）最适 pH3.2-4.0，含于肝脏、曲霉和酵母中。

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焦磷酸测序(Pyrosequencing)原理

相关专题 焦磷酸测序技术(pyrosequencing)是一种新型的酶联级联测序技术，焦磷酸测序法适于对已知的短序列的测序分析，其可重复性和精确性能与SangerDNA 测序法相媲美，而速度却大大的提高。焦磷酸测序技术产品具备同时对大量样品进行测序分析的能力，为大通量、低成本、适时、快速、直观地进行单核苷酸多态性(single nucle—otide potymorphisms，SNPs)研究和临床检验提供了非常理想的技术操作平台

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