基本方案 直接分析

1. 按适当百分比浓度制备聚丙烯酰胺分离胶，加入 10 mg/ml 激酶底物，使其在分离胶混合液中的终浓度达到 1 mg/ml。均匀混合后浇入制胶装置使其聚合。

2. 按通常的方法制备有激酶活性样品的 SDS-PAGE 电泳样品，电泳。

3. 电泳完毕后将胶放入 200 ml 20 %（V/V）2-丙醇/ 50 mmol/L Tris•Cl，pH 8.0 的洗液中，漂洗 20 min， 换入新的缓冲液，再重复 2 次。

4. 用 200 ml 的 1 mmol/L DTT/50 mmol/L Tris • Cl pH 8.0 洗 3 次，每次 20 min。

5. 用 250 ml 的 6 mol/L 盐酸胍 /1 mmol/L DTT/50 mmol/L Tris • Cl pH 8. 0 或 8 mol/L 脲/1 mmol/L DTT/50 mmol/L Tris • Cl pH 8.0 洗 2 次，每次 30 min。

6. 在 18 h 以上的周期内用 250 ml 的 1 mmol/L DTT/0.05 %（V/V）Tween 20/50 mmol/L Tris•Cl（pH 8.0）的溶液，4℃， 洗 8～10 次，使蛋白质充分复性。

7. 将胶放入 250 ml 与激酶匹配的反应缓冲液中（含 10 mmol/L MgCl₂），30℃，温浴 20 min。

8. 移走所有残存缓冲液，将胶放入带有密封盖的容器或可热密封的聚乙烯袋（容器应为放射性物质专用）。加入尽量少的激酶反应缓冲液，以正好覆盖胶面为准。加 1/4 反应缓冲液容积的 10 mmol/L Mg/ATP 溶液（终浓度 50 μmol/L ATP），最后加入 20 μCi/ml [γ-³²P] ATP。

9. 30℃，温浴 1 h。

10. 在 250 ml 的 5 % TCA 中将胶浸泡 15 min，重复一次。在 500 ml 1 % 焦磷酸钠/ 5 % TCA 中洗胶，重复洗涤，直至洗液几乎不含放射性物质。

11. 在滤纸上使胶干燥，放射自显影。

材料：

10 mmol/L 激酶底物，如髓鞘碱性蛋白

有激酶活性的酶样品（见用于激酶分析的细胞裂解实验），保持冰浴

试剂：

20%（V/V）2-丙醇／50 mmol/L Tris • Cl（室温下 pH 8.0）

1 mmol/L DTT / 50 mmol/L Tris • Cl（室温下 pH 8. 0）

6 mol/L 盐酸胍/ 1 mmol/L DTT / 50 mmol/L Tris • Cl（室温下 pH 8.0）或 8mol/L 脲/1 mmol/L DTT/50 mmol/L Tris • Cl（室温下 pH 8.0）

1 mmol/L DTT/0. 05%（V/V）Tween 20 /50 mmol/L Tris • Cl（4℃，pH 8.0）

匹配的激酶反应缓冲液

10 mmol/L Mg/ATP 溶液

10 mCi/ml [γ-³²P] ATP（3000 Ci/mmol； Amersham， DuPont NEN 或 ICN Biomedicals）

5%（m/V）三氯乙酸（TCA）

1 %（m/V）焦磷酸钠 /5%（m/V）TCA