balalaLy
一般证明自噬是用GFP-LC3做荧光染色,没有的话,可以直接就用LC3抗体做普通免疫荧光吗?
loveliufudan
对,如果没有GFP-LC3转染,也可以直接用LC3抗体做免疫荧光来检测自噬。主要步骤是:
1. 固定细胞,一般用4%多聚甲醛固定10-20分钟。
2. perfor化,用0.1-0.5% Triton X-100处理,打开细胞膜的孔隙。
3. 封闭,用5-10%的羊血清或BSA封闭1小时,减少非特异性染色。
4. 一抗,加LC3抗体(1:200-1:500稀释),4°C过夜。
5. 二抗,加入标有荧光素的二抗( FITC或TRITC标记),室温孵育1-2小时。
6. DAPI染色核 DNA,呈现蓝色。
7. 荧光显微镜下观察,LC3为绿色或红色点状荧光信号。
8. 可选做quantitative analysis,计算荧光点数,代表自噬小体的数量。
所以没有GFP-LC3,也可以通过抗体直接检测内源性LC3的点状荧光,评价自噬水平。需要优化每一步的条件,确保结果可靠。
huarenqiang5
可以直接用LC3抗体做普通免疫荧光,建议将LC3固定一下,这样可以防止降解。
sswei
LC3 抗体可应用于酶联免疫吸附测定, 免疫荧光, 免疫组化, 蛋白质印迹, 其他等领域。