有没有老师做过大鼠精原干细胞的提取，礼貌求方法

1.SSCs的分离及纯化

①机械法+两步酶法分离纯化SSCs:大鼠脱颈处死后无菌收集双侧睾丸，置于盛有HBSS的培养皿中,用眼科剪、镊仔细剥除脂肪垫、附睾、睾丸被膜，将组织剪至淤泥状，转移至清洁已消毒的10mL瓶中。加人相当于组织10倍体积的1LV型胶原酶溶液,用移液管反复吹打混匀，放人37℃培养箱中消化15min后取出再次用移液管反复吹打混匀，静置10min，吸出上清并弃之，向清洁已消毒10 mL瓶内加入复合酶消化液，用移液管反复吹打混匀,在37℃培养箱消化10min加入FBS终止胰蛋白酶消化,加人HBSS稀释并轻缓吹打。将消化后的细胞悬液分别经200目400目的筛网过滤后，将细胞悬液收集在离心管内，以1000r/min离心3min。弃上清,加入新鲜配制的完全培养液，调整细胞密度为undefined10'个mL。

②机械法+两步酶法+Percoll分离法分离纯化 SSCs:通过机械法+两步酶法收集细胞悬液后，取直径10mm的10mL离心管，从离心管底部开始用1mL移液管依由高到低浓度缓缓沿离心管侧壁加人梯度分离液各2mL.在分离液最上层缓缓加人细胞悬液。室温下以1700r/min水平离心30min细胞主要在相邻梯度的界面处形成细胞带:分布在细胞悬液层~10%Percoll梯度间的记为1带，分布在10%~25%Percoll梯度间的细胞较少记为2带分布在25%~35%Percoll梯度间的细胞数量最多记为3带分布在35%~50%Percoll梯度间的细胞也相对较少记为4带。收集3带细胞以HBSS漂洗2~3次后，加入新鲜配制的完全培养液重悬细胞。调整细胞密度为undefined10°个mL。

③机械法+两步酶法+percoll分离法+差速贴壁法分离纯化SSCs:将通过机械法+两步酶法+ percoll分离法得到的3带细胞悬液用光学透明纯聚苯乙烯制造的25cm²细胞培养瓶收集，在37℃ 体积分数为5%CO培养箱中孵育4h收集尚未贴壁的细胞，以1000r/min离心3min，加人培养液，重新调整细胞密度为3x10°个mL。

实验步骤

1、分离小鼠睾丸细胞

①向一个3.5 cm培养皿中加入1～2 mL预冷的DPBS。

②脱臼法处死小鼠，用外科手术器械打开腹腔，取出双侧睾丸，置于培养皿中，去除白膜，将睾丸用DPBS洗2～3遍。

③小心去除DPBS，向培养皿中加入1～2 mL 1mg/mL胶原酶Ⅳ，放置于37℃培养箱中孵育10～15 min。取出后用1 mL移液器小心吹打，将睾丸间质细胞吹散。

④将胶原酶Ⅳ小心去除，然后用DPBS轻轻洗两遍，去除D-PBS，加入0.8 mL0.25%胰蛋白酶和0.2 mL 7mg/mLDNase，37℃培养箱中孵育10 min。取出后用1 mL移液器充分吹打至细胞完全分散。

⑤加入5 mL细胞基础培养液终止胰蛋白酶反应。

⑥将上一步的细胞悬液用400目细胞筛过滤到离心管。

⑦室温1500 r/min离心5 min，弃上清，用精原干细胞培养液重悬细胞，并计数。

2、铺板和差异贴壁筛选

①用0.1%明胶包被1块12孔板，放置于室温或者37℃、5%CO2培养箱30 min以上。

①将细胞悬液转移到0.1%明胶包被过的12孔板中，细胞密度为2×105～4×105细胞/孔，每孔1 mL培养液。

②放入37℃、5%CO2培养箱中培养过夜。

③1 mL移液器反复吹打10～15次后将悬浮的细胞转移到另一12孔板中(Ryuet. al., 2005)。此时只有很少量的生殖细胞和大部分贴壁生长的体细胞残留在明胶铺被的12孔板上，而第二块板上生殖细胞相对富集(Oatleyet. al., 2006)。

实验流程

1. 分离曲细精管

- 取10-12天龄的雄性幼鼠，杀死并剥皮。

- 剪开腹部，取出睾丸并放入PBS液中。

- 用剪刀和针头将睾丸去除包膜，并剪碎。

- 将碎片转移到含有胶原酶的DMEM培养液中，振荡30分钟。

- 用筛网过滤掉大颗粒物，收集细胞悬液。

2. 分离精原干细胞

- 将细胞悬液转移到含有胰蛋白酶的DMEM培养液中，振荡15分钟。

- 用筛网过滤掉大颗粒物，收集细胞悬液。

- 将细胞悬液与Percoll溶液按比例混合，制备不同密度的梯度液。

- 将梯度液分层装入离心管中，离心20分钟。

- 收集第3、4、5、6带的细胞悬液，这些是富含精原干细胞的部分。

3. 纯化精原干细胞

- 将收集的细胞悬液与PBS液按比例混合，离心5分钟。

- 弃去上清液，重悬细胞沉淀。

- 将重悬的细胞接种于丝裂酶素处理的大鼠胎儿成纤维细胞或小鼠STO成纤维细胞饲养层上，使用含有巯基乙醇、VA、VC、VE、丙酮酸钠、乳酸及胎清的MEM培养液进行培养。

- 每隔2-3天更换一次培养液，观察细胞生长情况。

4. 鉴定精原干细胞

- 从培养皿中取出一部分细胞，制备玻片或冰冻切片。

- 用精原干细胞表面特异性抗原（如GFRα1、PLZF等）进行免疫荧光染色或免疫组化染色。

- 用荧光显微镜或光学显微镜观察染色结果，计算染色阳性率，评估精原干细胞的纯度。

步骤一、原代分离大鼠精原干细胞：从出生后7-9天的雄性大鼠乳鼠睾丸中分离精原干细胞，通过差异贴壁和percoll分离获得大鼠精原干细胞，具体为：

取7-9天wistar雄性大鼠，剖开睾丸白膜，分离暴露曲细精管，加入4ml的hbss溶解的10μg/ml的iv型胶原酶置于37℃消化；再使用3ml体积的300μg/ml的dnase洗2-4次，600g离心后沉淀，加入4ml含1mm浓度edta的0.25％胰酶轻轻吹打37℃消化；10％血清终止消化后过筛网移除未消化的大块组织；于600g离心5分钟，弃去上清；将细胞以2ml培养基重悬后，加入到预先铺有50％、35％、25％、10％各1ml的percoll使用液的采血管中，整个percoll体系以600g离心50分钟；待离心后，可见50％与35％之间出现密集细胞带，吸出成带部分组分，hbss清洗两遍后，以3×107个/ml接种培养。

步骤二、对分离出的大鼠精原干细胞使用无饲养层培养体系培养，具体为：

采用含150ng/mlgfrα1、20ng/mlegf、10ng/mlbfgf的10％血清dmem/f12培养基，培养基补充成分为6g/l葡萄糖、25mg/l胰岛素、10-4mol/l维生素c、10mg/l生物素、非必须氨基酸补充液、维生素补充液；4h后移取悬浮细胞组分单独培养，隔天换液，3-4天传代；待3-4日培养后，细胞融合至80％，移去半数上清液，将下层悬浮细胞轻轻吹起，收集后以1：2均匀传代并补充培养基。