请问大家怎么做好Transwell分离培养?

1.

细胞悬液 200µl 加入 Transwell 小室(肿瘤细胞数目需要摸浓度,从 2 万,5 万,10 万)。

2.

24 孔板下室一般加入 600µl 含 15%FBS 的培养基,特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失。在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。

3.

养细胞:常规培养 12-48h(主要依癌细胞侵袭能力而定)

实验步骤：

实验前准备：transwell 小室（一般选12um），24 孔板，基质胶（corning），细胞实验所需的基本的材料。

1、基质胶铺板

用 Matrigel 1：8 稀释（可以直接用无血清的培养基稀释），包被 Transwell 小室底部膜的上室面，置 37℃孵箱 1-4h 使 Matrigel 聚合成凝胶。

注意事项：

1). 铺胶之前将枪头以及所用的耗材至于冰箱 4 度当中，否则配胶的时候会直接凝固。

2). 铺胶的厚度自己摸索，25ul，40ul，100ul。

3). 注意铺胶过程不要产生气泡，铺胶均匀，否则影响实验结果。

4). 注意无菌操作。

2、制作细胞悬液

1). 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿 12－24h，进一步去除血清的影响。

2). 消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用 PBS 洗 1－2 遍，这一步很必要，否则细胞表面覆有血清培养基，细胞没有迁移侵袭的动力），用无血清培养基重悬。

3、接种细胞

1). 细胞悬液 200µl 加入 Transwell 小室（肿瘤细胞数目需要摸浓度，从 2 万，5 万，10 万）。

2). 24 孔板下室一般加入 600µl 含 15%FBS 的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失。在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。

3). 养细胞：常规培养 12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。24h 较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。

4、固定染色

取出 Transwell 小室，弃去孔中培养液，用无钙的 PBS 洗 2 遍，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，甲醇或者甲醛固定 30 分钟，将小室适当风干。用 0.1% 结晶紫染色 30-60 min，用 PBS 洗 3 遍。用棉签轻轻擦掉上室水分。

5、计数

400 倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数。

要做好Transwell分离培养，以下是一些建议：

1. 准备Transwell装置：确保Transwell装置（也称为Transwell孔板或细胞迁移孔板）是清洁的，并在使用前进行灭菌处理。检查Transwell滤膜是否完好无损，无污染。

2. 细胞准备：根据你的实验目的，培养和准备需要的细胞类型。注意选择合适的细胞密度和培养基来确保细胞在Transwell装置中的适当生长和迁移。

3. 预处理Transwell滤膜：根据具体实验需求，预处理Transwell滤膜。例如，你可以在Transwell滤膜上涂布基底膜成分、胶原蛋白或其他适当的涂层物质，以促进细胞附着和迁移。

4. 细胞接种：将培养好的细胞悬液均匀地加入Transwell孔的上室（上腔），根据需要的细胞数目和实验设计确定接种量。

5. 添加培养基：在Transwell下室（下腔）中添加适当的培养基。这样，细胞将在上室和下室之间建立一个物理障栅，可以通过Transwell滤膜进行细胞迁移。

6. 培养条件：将Transwell装置放置在细胞培养箱中，并提供适当的培养条件，如温度、湿度和CO2浓度。根据你的实验需求和细胞类型，确定适当的培养时间。

7. 实验结束和分析：在培养结束后，可以通过分离Transwell装置，进行细胞的染色、显微观察或其他相关实验。根据你的实验目的，进行合适的细胞分析和数据处理。

在开始消化铺板之前，我们需要给Transwell小室提前铺上人工基质胶，人工基质胶与coatingbuffer的比例为1:40，混好人工基质胶后加入Transwell小室中，再把Transwell小室放入深孔24孔板中一起放进细胞培养箱赙育2小时。

孵育结束后用移液器把多余的人工基质胶吸出弃掉，再用相应的纯培养基清洗两道三次，去除残余的人工基质胶。

接着我们对细胞进行铺板，用胰蛋白酶消化液把贴壁细胞消化下来，吹打混匀后上细胞计数仪进行细胞计数。Transwell小室里面我们铺上10万个细胞，并且保证小室内为无血清培养基0.2 ml，在放置Transwell小室的深孔24孔板中加入700微升的带有血清的完全培养基，血清就起到了趋化因子的作用可以使得细胞从Transwell小室的无血清环境中，迁移到24孔板有血清的环境中。

根据不同细胞的迁移情况选择在24-48小时取出Transwell小室，去细胞进行后续处理。首先，取出小室后用PBS清洗几遍，动作要轻柔避免人为因素导致细胞脱落。接着用棉签擦去小室上未穿过去的细胞，再次用PBS清洗干净，紧接着把小室放入甲醇中固定15-20分钟，防止细胞在染色冲洗时脱落。

固定结束后也要用PBS清洗去除甲醇的影响，清洗后把Transwell小室放入终浓度为0.1%的结晶紫染液中染色半个小时，然后再把染色液用流水冲洗干净。最后把冲洗好的小室放在显微镜下观察拍照。