贴壁的哺乳动物细胞的转染实验完整做法

贴壁细胞的转染:

在准备做细胞转染的前一天把细胞铺进细胞培养皿中，加入完全培养基培养24小时，使得细胞汇合度达到百分之六十到百分之八十。在转染前需要把完全培养基换成无双抗的完全培养基，以排除双抗对转染效率的影响。根据转染的细胞数不同选取适量的纯培养基分别稀释质粒和lipo3000，其中稀释完的质粒中加入p3000充分混匀后再加入稀释过的lipo3000中，把混合液轻柔的吹打混匀，室温孵育20分钟。孵育结束后把质粒-p3000-lipo3000混合液加入细胞培养皿中，然后再轻轻摇匀，放入细胞培养箱中继续培养6个小时，再更换成带有双抗的完全培养基即可。

细胞转染

（1）转染试剂的准备

A. 将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。

B.震荡后将试剂放在-20℃保存，使用前还需震荡，。

（2） 选择合适的混合比例（1：1-1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。

（3） 将混合液在室温放置10-15分钟。

（4） 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。

（5） 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。

（6） 到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24-48小时。

贴壁的哺乳动物细胞转染过程：

　　1. 在六孔板或35mm培养皿中接种2ml(完全培养基)约1.3×105细胞。

　　2. 37℃、5％CO2条件下培养细胞至50-80％丰度。

　　3. 在两个1.5ml离心管中准备如下溶液：

　　溶液A：溶1-2 μg DNA于100μl无血清培养基中

　　溶液B：溶2-25μl脂质体(GIBCO BRL：LIPOFECTAMINETM Reagent)于100μl无血清培养基中

　　4. 将上述A、B两液混合，室温下放置15-45分钟。此时可将细胞用2ml无血清培养基漂洗1-2遍。

　　5. 混合的A、B两液中加入0.8ml无血清培养基，混匀，平铺在漂洗过的细胞上。如果细胞对无血清耐受能力差，这一步可加入血清。但是在转染过程中不要加入抗生素(antibiotic)。

　　6．37℃、5％CO2条件下培养2-24小时。

　　7. 加入lml培养基(含两倍于正常浓度的血清)。若血清已加入，这一步可加入lml正常的完全培养基。

　　8. 在转染后的18-24小时换入新鲜的完全培养基。

　　9．根据细胞类型及启动子的活性，在24-72小时可对基因的表达活性进行分析。

　　10. 在转染后的18-24小时，可将细胞按1:10传入选择培养基中进行筛选。

　　2.转染开始

　　1. 用无血清、无抗生素(antibiotic)的培养基漂洗细胞1-2遍。

　　2．在六孔板或35mm培养皿中接种0.8ml(无血清培养基)约2-3×106细胞。

　　3. 在两个1.5ml离心管中准备如下溶液：

　　溶液A：溶1-2μgDNA于100μl无血清培养基中

　　溶液B：溶2-25μl脂质体(GIBCO BRL：LIPOFECTAMINETM Reagent)无血清培养基中

　　4．将上述A、B两液混合，室温下放置15-45分钟。

　　5．将混合液加入细胞悬液中，混匀，37℃、5％CO2条件下培养2-24小时。

　　6．加入4ml完全培养基，37℃、5％CO2培养24-72小时．

　　7．倒掉培养基，蓝光激发下观察绿色荧光。

脂质体转染:

吸去细胞培养皿/培养孔板中的旧培养基，用预温PBS或者无血清培养基清洗，去除残留血清。更换无血清和双抗的基础培养基（6孔板2毫升/孔），放37度培养箱培养。同时准备转染液，用灭菌后的EP管制备。以六孔板一个孔的量为例：

　　A液：用250μl Opti-MEM稀释4μg质

　　B液：用250μl Opti-MEM稀释10μl lipo2000。

　　分别将A液、B液轻轻混匀，室温静置5min，将B液全部加入至A液中，轻轻混匀，室温静置20min。

　　将转染混合液均匀滴加到每个孔中轻轻混匀，放培养箱培养4 h-6 h后，去除质粒复合物，更换成完全培养基，继续培养到24-48小时(不同的质粒和脂质体最佳搭配比例不同，转染前，应该摸一个最佳配比。质粒：脂质体=1：1，1：1.5，1：2，1：2.5，1：3，1：3.5的梯度比例来检测最佳转染比例，一般质粒有带荧光，可以通过观察每组荧光强弱来判断转染效率)。以下为不同规格的培养板需要加DNA和lipo2000的量。