求助小鼠颅骨成骨细胞提取

看了文献的方法，尝试了很多次，都提不出细胞。有没有大神可以指点指点，非常感谢。实验步骤如下，

新生小鼠颅骨成骨细胞的分离培养

1.斩首 20-30 只新生小鼠幼崽。

2.用乙醇喷洒消毒。

4.从脖子后部到鼻子的弧形切割皮肤。

5.用剪刀剪下颅盖骨，置于培养皿中。

6.刮掉颅盖上的软组织。

7.培养皿中加入含双抗的培养基清洗组织，重复3次。

8.用胰蛋白酶在37℃下孵育10分钟，重复2次。

9.用剪刀将颅骨碎成小块（1 mm3 块）。

10.加入消化液在37℃下孵育30分钟。

消化液：-α-MEM

- 0.2%Ⅰ型胶原酶

- 0.1 % trypsin/EDTA

11.换新鲜的消化液37℃下孵育60分钟。

12. 将溶液转移到15毫升管中。

13.在室温下以1,500×g离心细胞溶液5分钟。丢弃上清液并将细胞沉淀重悬于MEM中。

14.加入20毫升MEM至2个T75。 

15.培养瓶孵育在37℃/ 5％CO2。