麦胚凝聚素结合法

1. 制备样品：将待测的蛋白质样品纯化并浓缩至适当的浓度，通常需要去除杂质和其他成分。
2. 准备麦胚凝聚素：购买或制备适当浓度的麦胚凝聚素溶液。
3. 准备用于检测的微孔板：将麦胚凝聚素涂在微孔板上，使其与微孔板表面结合。
4. 加入样品：将待测的蛋白质样品加入到微孔板孔中，让其与麦胚凝聚素结合。
5. 洗涤：用适当的缓冲液洗涤微孔板，去除未结合的蛋白质和其他杂质。
6. 加入检测抗体：加入适当的抗体，与待测蛋白质结合。
7. 加入检测物质：加入检测物质，如酶标记的二抗或化学发光物质。
8. 洗涤：再次用适当的缓冲液洗涤微孔板，去除未结合的抗体和其他杂质。
9. 读板：通过测量检测物质的信号强度，确定待测蛋白质的含量或结合情况。 总之，麦胚凝聚素结合法通过麦胚凝聚素与糖蛋白的结合来检测糖蛋白的存在和含量，是一种简单、快速、灵敏的分析方法。

麦胚凝聚素（WGA）是一种具有亲和力的蛋白质，可以与寡糖和N-乙酰葡萄糖胺结构结合，因此被广泛用于细胞表面糖基的检测和分离。下面是麦胚凝聚素结合法的具体步骤：

细胞处理：将需要检测的细胞按照实验设计处理，如不同时间、不同剂量的药物处理等。

固定细胞：用4%的多聚甲醛或者乙醛溶液固定细胞。使用多聚甲醛需要进行去交联处理，如使用0.1 M甲醛或者1 mM二硫苏糖醇（DTT）等。

孔板处理：在24孔培养板或96孔培养板中，加入PBS或其他适合的缓冲液，再加入0.1%的WGA（如使用荧光标记的WGA，则需要减少浓度），在室温下孵育1小时以上。

洗涤孔板：将孔板中的PBS或其他缓冲液洗去，加入1%的牛血清蛋白或其他蛋白质阻断孔板。

加入固定细胞：将步骤2中固定好的细胞加入孔板中，再次在室温下孵育1小时以上。

洗涤孔板：将孔板中的PBS或其他缓冲液洗去。

染色：加入适当浓度的荧光标记的抗体，如FITC标记的抗体，室温下孵育1小时以上。

洗涤孔板：将孔板中的PBS或其他缓冲液洗去。

检测：使用荧光显微镜观察细胞表面的荧光强度，并进行记录和分析。

需要注意的是，每个实验的具体步骤会根据不同的研究目的和细胞类型进行一些修改和优化。

操作步骤：

　　1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为48μg/L，32μg/L，16μg/L，8μg/L，4μg/L）。

　　2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

　　3.温育：用封板膜封板后置温育30分钟。

　　4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。

　　5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

　　6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

　　7.温育：操作同3。

　　8.洗涤：操作同5。

　　9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，避光显色15分钟.

　　10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

　　11.测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。