EMSA结合带检测不到

求助各位大神！好着急啊要毕业了结果一直做不出来能上的图

EMSA游离探针明显减少而结合带没有是咋回事啊？我是研究蛋白突变后还能不能结合DNA，探针我之前做过能够做出来，但现在死活做不出来了

探针是公司合成的生物素修饰的探针，用的Thermo的核质分离试剂盒，提取完反应体系和反应液都是用的Thermo的，电泳的page胶是网上查的，第一次是6%，第二次是4%，100v跑了56min，转膜340mA转50min（第二次换了380mA），交联在超净台（距离比较远）紫外照射30min，后面化学发光也是用的thermo的

第一张图片明显WT组游离探针量减少很多，但是感觉结合带看起来不太像（发光发了10min），很像聚集在点样孔里面了，但是旁边空载（没有过表达目的蛋白）没有聚集，

怀疑自己胶浓度太高了就调成了4%的，转膜调成380mA，结果看起来好像都聚集在点样孔了

根据在丁香园看的经验贴分析原因如下：

1.胶浓度太高，我第一次跑是6%，第二次调成4%，结果感觉还没第一次跑的好（难道是因为我第二次把电压从340mA调成了380mA转过了？

2.蛋白浓度过高？我第一次蛋白加了20ug（3ul）左右（因为之前加的少检测不到，做过梯度感觉浓度高了好一点），第一次mut1（突变蛋白）没有结合带（但是之前的做出来是可以结合的，只是结合变少，所以第二次就多加了几ug，差不多28ug（4ul）左右