H9C2细胞状态差，经常养着养着就漂了

可能是血清问题，建议换血清，也有可能是细胞生长密集，需要及时传代。

H9C2细胞复苏步骤

1.将含有1 mL H9c2 （2-1）细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀；

2.在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后轻轻吹匀；

3.将所有H9c2 （2-1）细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6 cm皿中，加入约4 mL培养基，培养过夜）；

4.第二天换液并检查H9C2细胞密度。

H9C2细胞传代步骤

如果H9C2细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗H9C2细胞1-2次。

2.加入1 mL 0.25%Trypsin-0.02%EDTA 消化液于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1-3 min，然后在显微镜下观察H9C2细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

4.将H9C2细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

H9C2细胞冻存步骤

待H9C2细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为例

1.收集H9C2细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，然后进行细胞计数。

2.根据H9C2细胞数量对应加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3.将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

有可能是培养瓶的材质影响贴壁的

1.检测一下支原体 2，换好点的血清 3，减少一下胰酶消化时间

可能是血清问题，建议换血清，并注意血清要程序解冻，不能水浴化开；也有可能是细胞生长密集，需要及时传代，并不是细胞长满才传代，当有个别地方长得过于密集，容易叠加的时候应该就要传代了。