消化法（细胞传代实验）

用胰蛋白酶消化细胞，用于贴壁细胞传代培养。

细胞胰蛋白酶、75% 酒精、PBS 超净工作台、酒精灯、酒精棉球、37 ℃ 细胞培养箱、显微镜、离心管、离心机、移液枪、枪头、细胞培养基

一、传代前准备

1. 预热培养用液：把配制好的装有培养液、PBS 液和胰蛋白酶的瓶子放入 37 ℃ 水浴锅内预热。

2. 用 75% 酒精擦拭紫外线照射后的超净工作台和双手。

3. 点燃酒精灯，注意火焰不能太小。

4. 取出预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后放入超净台内。

5. 从培养箱内取出细胞，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。

6. 把细胞放入超净工作台，打开瓶口，打开后要在酒精灯上烧口消毒。

二、胰蛋白酶消化

1. 去除培养液，加入 PBS 轻轻洗涤 1 次，然后加入适量胰蛋白酶，加入量以盖住细胞最好，放入培养箱内消化。

2. 显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度，停止消化。

3. 去除胰蛋白酶液，加入新鲜的培养液终止消化。

三、吹打分散细胞

1. 用移液枪将细胞吹打成细胞悬液，将细胞悬液收集至 15 ml 离心管中。

2. 平衡后将离心管放入台式离心机中，以 1 000 转/分钟离心 5 分钟。

3. 弃上清液，加入 2 ml 新培养液，轻轻吹打细胞制成细胞悬液。

四、分装稀释细胞并培养

将细胞悬液吸出分装至 2~3 个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖，放入 37 ℃ 培养箱中培养，放入培养箱中后适当拧松瓶盖。

1、严格的无菌操作。

2、适度消化：消化的时间受细胞类型、消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。

3、正确摆放使用的器械，保证工作台内足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。

4、从培养箱内取出细胞时要旋紧瓶盖，防止污染。

5、吹打细胞时要轻柔，防止细胞破碎。

6、细胞传代密度不宜太大或太小，密度过小会影响细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于 5 × 10⁵/ml。

7、放入培养箱中培养的细胞培养瓶的瓶盖不宜过紧，适当拧松。

根据细胞生长的恃点，传代方法有 3 种：悬浮生长细胞传代、半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）、贴壁生长细胞传代。培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。贴壁生长的细胞用消化法传代；部分贴壁生长的细胞用直接吹打法传代；悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代。