做双酶切原本质粒大小3400多bp，两酶切位点之间的片段40多bp，为什么切下来跑胶只有2000多bp，不应是3000多bp么？

提得好的质粒应该绝大部分是超螺旋的，跑得比marker的线性条带快。如果你5K的质粒真跑到5K的位置，才是没提好呢。想确定质粒的分子量最简单的办法是用单酶切成线性分子，再和marker比较。

可能你的酶切位点不是单一位点，也可能你的酶有星号活性，切乱了。你最好按照酶的说明书的时间和配比来做

你可以进行测序看看切下来的片段序列，是不是存在中间酶切位点

切割之前的质粒是环状结构，在切割之后变成线状结构，会导致跑胶的时候速度不统一。

首先确认你的marker是不是线性DNAmarker而不是质粒marker。然后看一下质粒的酶切位点是不是唯一的，即中间部分是不是也有你的酶切位点。