请问原代培养的细胞转染需要注意什么?

1.细胞接种：一般做转染前一天接种/铺板（细胞计数大约undefined10^4cell/ml），使做转染前细胞密度在30-50%；如果细胞是原代细胞，接种密度可以密一些，细胞计数在undefined10^6cell/ml；悬浮细胞可以在转染当天接种/铺板（细胞计数大约undefined10^4cell/ml），待细胞状态稳定后做转染前细胞密度30-40%。

2.为了能在使用时有较好的转染效果，第一次使用建议您用24孔板做，每孔2ul转染试剂即可。将最佳转染条件（siRNA与转染试剂的用量、比例）放大到对应的孔板即可。

3.设置siRNA终浓度10nM,30nM,50nM,100nM四个梯度，每个梯度最好做2-3个复孔（至少2个复孔，避免实验误差）。

4.用来稀释siRNA和稀释转染试剂的培养基必须是无血清培养基，因为血清的存在会干扰siRNA与转染试剂的混合，并且影响转染效率。

5.检测方法：转染后48h收细胞做qPCR基因水平检测或者转染后72h收细胞提蛋白做western Blotting蛋白水平检测

原代细胞转染siRNA，可以用opti-MEM和RnaiMAX配合使用

原代细胞一点要认真选择转染方法！

实验室使用较多的主要有化学介导中的脂质体转染（质粒转染）和生物介导中的慢病毒转染法。其中质粒转染操作简单，一般瞬时转染选择较多，但有些细胞系不容易转染。

使用病毒转染一般具有能够稳定表达的优势，且其对原代细胞有较高的转染效率，其中更分为慢病毒转染，逆转录病毒转染和腺病毒转染，其中腺病毒转染可适合更为难转染的细胞，例如悬浮细胞、T细胞、raw细胞等难转染细胞。

原代细胞和传代次数多的细胞都不是最佳选择，处于对数生长期的细胞生长状态最好，最适合转染。

同时细胞的密度不宜过大，大家往往注意的都是转染前的密度，失败过很多次的经历告诉大家，转染后的细胞密度更加重要。

有时候转染时间太久，等到进行后续实验时细胞已经肆意生长，漂起来了，岂不前功尽弃，流着眼泪也要告诉大家，考虑好细胞的生长周期和转染的时间进行铺板，建议选择50%~80%区间密度进行细胞转染。