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请问原代培养的细胞转染需要注意什么?

相关实验:神经细胞原代培养实验

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dxy_lexw4uke

预备使用原代大鼠神经干细胞,并进行siRNA细胞转染,请问转染方法和使用试剂有推荐的吗?

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4 个回答

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天一湖医者

有帮助

1.细胞接种:一般做转染前一天接种/铺板(细胞计数大约undefined10^4cell/ml),使做转染前细胞密度在30-50%;如果细胞是原代细胞,接种密度可以密一些,细胞计数在undefined10^6cell/ml;悬浮细胞可以在转染当天接种/铺板(细胞计数大约undefined10^4cell/ml),待细胞状态稳定后做转染前细胞密度30-40%。

2.为了能在使用时有较好的转染效果,第一次使用建议您用24孔板做,每孔2ul转染试剂即可。将最佳转染条件(siRNA与转染试剂的用量、比例)放大到对应的孔板即可。

3.设置siRNA终浓度10nM,30nM,50nM,100nM四个梯度,每个梯度最好做2-3个复孔(至少2个复孔,避免实验误差)。

4.用来稀释siRNA和稀释转染试剂的培养基必须是无血清培养基,因为血清的存在会干扰siRNA与转染试剂的混合,并且影响转染效率。

5.检测方法:转染后48h收细胞做qPCR基因水平检测或者转染后72h收细胞提蛋白做western Blotting蛋白水平检测

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bamboopiggy

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原代细胞转染siRNA,可以用opti-MEM和RnaiMAX配合使用

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未来9

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原代细胞一点要认真选择转染方法!

实验室使用较多的主要有化学介导中的脂质体转染(质粒转染)和生物介导中的慢病毒转染法。其中质粒转染操作简单,一般瞬时转染选择较多,但有些细胞系不容易转染。

使用病毒转染一般具有能够稳定表达的优势,且其对原代细胞有较高的转染效率,其中更分为慢病毒转染,逆转录病毒转染和腺病毒转染,其中腺病毒转染可适合更为难转染的细胞,例如悬浮细胞、T细胞、raw细胞等难转染细胞。

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迟C迟

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原代细胞和传代次数多的细胞都不是最佳选择,处于对数生长期的细胞生长状态最好,最适合转染。

同时细胞的密度不宜过大,大家往往注意的都是转染前的密度,失败过很多次的经历告诉大家,转染后的细胞密度更加重要。

有时候转染时间太久,等到进行后续实验时细胞已经肆意生长,漂起来了,岂不前功尽弃,流着眼泪也要告诉大家,考虑好细胞的生长周期和转染的时间进行铺板,建议选择50%~80%区间密度进行细胞转染。

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