怎么提取鼠心脏成纤维细胞

改良联合酶消化法可以稳定的提取成年小鼠原代心脏成纤维细胞。

心肌成纤维细胞分离方法大概有两种:（1）贴块法（2）消化法，这两种方法都可以用于分离和培养原代细胞。

1. 小鼠颈椎脱臼处死后，剃除腹胸部的被毛，放入装有75%酒精的烧杯中浸泡5min。

2. 取出小鼠，在无菌环境下打开胸腔，取出心脏组织，注入盛有无菌1×PBS的培养皿中，洗净组织表面的血液。

3. 将清洗干净的心脏组织转入装有75%酒精的培养皿中浸泡15s以杀死大多数的心脏被膜细胞，浸泡完成后立即转入装有无菌1×PBS的培养皿中震荡清洗。

4. 清洗完成后，用剪刀镊子配合除去主动脉弓和心房组织，仅保留心室部分，再次用1×PBS清洗去除心室内的血液。

5. 将清洗干净的心室组织用剪刀减成1mm3大小左右的碎块，之后用PBS清洗若干次后按下述两种方法之一进行后续操作。

A.贴块法

6. 将清洗好的碎块转入另一培养皿中，用0.25%胰蛋白酶消化液浸泡组织，室温消化3-5min。

7. 消化完成后，添加数毫升FBS终止消化，之后吸弃液体，加PBS清洗组织块1伺次后，用200ul吸头将组织块平均接种于T-25培养瓶的培养面上，之后将培养瓶放置于37℃二氧化碳培养箱中，静置2-4h。

8. 待组织处于略微脱水的状态时，小心添加2ml完全培养基，添加时注意尽量不要将组织块冲起，要使培养基接触所有的组织块。

9. 之后放入培养箱中继续培养，一般2-4天后成纤维细胞会从组织块周围爬出，待爬出的细胞有较多数量时，可将细胞消化下来，去除组织块，转入另一培养瓶中培养。

B.消化法

6. 将清洗好的碎块转入另一离心管中，加入混合消化液（0.08%胰酶+0.06%Ⅱ型胶原酶）37℃水浴消化8min后，吸取上层混悬液弃去。

7. 余下组织加入混合消化液10ml，37℃水浴震荡消化10min；吸取上层悬液至另一离心管中，加入适量FBS终止反应；剩余沉淀物再加消化液消化3-5次，直至组织块完全消化。

8. 按1∶1加入含血清的培养基，中止酶反应，悬液过150目网筛去除较大的组织块。

9. 收集全部中止后的消化液于离心管中，300g，离心10 min，弃去上清，加入培养液重悬细胞后计活细胞数。

10. 调整细胞密度以1× 106个/ml 接种入的T-25培养瓶中，每瓶添加2ml细胞悬液。

11. 培养瓶放置于37℃，5% CO2培养箱中静置40min后，吸弃上清液以去除未贴壁的非成纤维细胞和死细胞，再添加5ml完全培养基继续培养。

一种从小鼠心脏分离提取纤维细胞的方法，包括以下步骤：

6.1)取小鼠心脏组织，用含有10％胎牛血清的1640培养基清洗干净，加入ⅰ型和ⅱ型胶原酶溶液，将组织切或剪成细块，再加入30mmol/l牛磺酸、10mmol/l的hepes和0.5μg/ml dnase，在37℃下进行消化，消化5～30min；

7.2)将消化完的组织进行反复研磨，用细胞过滤器过滤，使细胞全部通过网筛，将滤液进行离心分离，弃上清液，加入红细胞裂解液，裂解后，加入含10％血清的1640培养基终

止裂解，离心；

8.3)弃上清液，加入样本稀释液重悬细胞，将细胞稀释成单细胞悬液，然后加入到组织白细胞分离液的液面上，离心,吸取环状乳白色的细胞层，用pbs缓冲液清洗细胞，离心，反复清洗2～3次，即得到纯化的心肌组织白细胞；

9.4)进行细胞计数，将上步得到的细胞在6孔板中以2

×

106在含有20％胎牛血清、2mmol/l的l-谷氨酰胺、100u/ml青霉素、100mg/ml链霉素的dmem中培养(37℃，5％的co2)3天后，去除未贴壁的t细胞，更换新鲜培养基，继续培养十四天后，使用抗小鼠的cd14免疫磁珠对上述得到的细胞群体进行分选，去除cd14+的单核细胞群，得到心脏纤维细胞。

10.5)心脏纤维细胞的流式细胞鉴定，包括以下过程：

11.a)将上步得到的心脏纤维细胞通过pbs清洗、常规胰酶消化后得到细胞沉淀，重悬细胞为单细胞悬液，在细胞悬液中加入抗体封闭液，重悬细胞，4℃下孵育10min，pbs缓冲液重悬细胞，离心；

12.b)弃上清液，加入pbs缓冲液重悬细胞，加入表面抗体和活细胞染色marker fixable viability dye efluor

tm

780，在室温下避光孵育15min，加入pbs缓冲液重悬细胞，离心；

13.c)弃上清液后涡旋，加入多聚甲醛固定液重悬细胞后，于4℃避光孵育20min，加入洗涤液，离心；

14.d)弃上清液,再加入洗涤液重悬细胞，加入胞内抗体，室温避光孵育25min，然后加入pbs缓冲液重悬细胞，离心；

15.e)弃上清液,加入稀释的间标二抗,室温避光孵育25min，然后加入pbs缓冲液重悬细胞，离心。弃上清液，加入pbs缓冲液重悬细胞即可上流式细胞仪进行检测。

16.6)心脏纤维细胞的免疫荧光染色鉴定。

心肌成纤维细胞分离提取方法有两种，一种是贴块法，一种是消化法。