从哺乳动物细胞中制备核和细胞质提取物

1a) 收集转瓶培养的细胞：将 5× 108〜10× 108 细胞置 1 L 的塑料瓶 1850 g 离心 20 min。轻轻倒去上清并丢弃，将细胞转入50 mL 锥形刻度离心管中（每管 2〜3 L 培养液中的细胞）。进行步骤 2。1b) 收集单层培养的细胞：单层细胞长满后去掉培养液。用足量 PBS 洗 1 次，PBS 用 量为没过细胞，轻轻振荡，弃 PBS。将细胞刮入新鲜 PBS 液里，倒进锥形

1) 按基本方案中步骤1〜8操作。2) 在低盐缓冲液中重悬细胞核后（1/2体积pnv，见基本方案步骤8)，将细胞核悬液分成5等份。3) 在冷室内不断搅拌，按如下方法在每份悬液中加入1/3体积高盐缓冲液：在第1份 中加KCl浓度最低（0.8 mol/L)的高盐缓冲液，其余各份中依次加入KCl浓度逐 渐增高（直到1. 6 mol/L)的高盐缓冲液。4) 确定在离心管斜面上有提取出的细胞核，轻轻混合30

1) 仔细测量细胞质提取物的体积（见基本方案步骤 7 中的上清）。加入 0.11 倍体积的10×细胞质提取缓冲液，充分混合。2)100 000 g 离心 1 h。3)将上清（± 100) 装入透析管中进行透析，直至与S-100 的电导率达到与透析缓冲液一致（100 mmol/L KCL)。4)从透析管移出上清（±100）,25000 g 离心 20 min,以收集沉淀组分。5)轻轻倒出上清，检测其