爪蟾中期提取物制备
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1． 冷却离心机至16 o C
2． 配工作液（MMR、XB、XEB2），准备玻璃容器，用蒸馏水冲洗
3． 收卵在玻璃容器中（烧杯、或者锥形瓶），将水去除。卵不可以暴露在空气中
4． 用1X MMR轻轻洗卵，初步挑除坏卵，主要是去除杂质。（卵的质量对于提取物制备的结果有很大影响，挑卵最好用塑料的吸管，卵一般要去除10％－33%）。MMR洗三次。然后将MMR去除，速度要快，以免卵发生氧化。(XB洗一次)
5． 用1X MMR配300ml 2％cystein，室温下去除胶膜（在用之前1h之内配制）。先加入1/3体积的cystein，轻轻转动1min，倒掉液体（应该很脏）；再加入1/3体积cystein，轻轻转动2min。此时应有很好的胶膜去除效果，若仍未去除干净，则将余下的1/3cystein加入，处理2min。将cystein去除干净。(去胶膜时间不能过长，一般不超过5min，时间太长会使卵破裂，而破裂的卵对CSF的影响非常大)
6． 用XBE2轻轻洗三次卵。用塑料吸管挑坏卵，将灰色的和白面向上的卵全都扔掉。
7． 在10ml 离心管 中预先加入1ml的XBE2/LPC（lepeptin/pepstatin/chymostatin），以及100ug/ml cytochalasin B，用塑料吸管将卵转入，然后再去除buffer。
8． 加1ml silicon oil，使卵与空气隔绝， 400rpm，1 min，16 o C
9． 吸净silicon oil和buffer，11000rpm，16 o C离心10min。在最终得到提取物之前，不能将卵置于4 o C
10. 观察分层情况，吸取中间层液体，不要贪心。注意提取物始终放在冰上。
11. 加LPC、10ug/ml cytochalasin D和energy mix，用枪头轻轻混匀，或轻轻颠倒。
MMR:
5 mM HEPES, pH 7.8
0.1 mM EDTA
100 mM NaCl
2 mM KCl
1 mM MgCl2
2 mM CaCl2
Store at RT.
20x XB stock ：
2 M KCl
20 mM MgCl 2
2 mM CaCl 2
XB:
10 mM HEPES -K, pH 7.7
1x XB stock
50 mM sucrose
CSF-XB:
10 mM HEPES , pH 7.7
1 mM MgCl2
1x XB stock
5 mM EGTA-K
50 mM sucrose
Dejellying solution:
2 % cysteine; 1X MMR salts, pH 7.8 （KOH）
300 ml- make within 1 hour of use.
Energy Mix:
150 mM creatine phosphate
20 mM ATP
2 mM EGTA
20 mM MgCl2
100 ul aliquots- store at -20 deg C.
37 ％ Paraformaldehyde solution ：
1.85g paraformaldehyde add to 3.5ml H 2 O, plus 100ul of 1N KOH. Dissolve in a hot water bath, shaking. Filter through 0.2um filter, cool up to r.t.
Extract Fix:
for 5ml from stock
60% (v/v) glycerol 3ml 100%
1x MMR 0.2ml 25X
Hochest 33342 1ul (1:10000)
4% formaldehyde 0.54ml 37%(w/v)
Sperm dilution buffer:
for 10ml from stock
10mM Hepes, pH 7.7 100ul 1M
1mM MgCl 2 10ul 1M
100mM KCl 1ml 1M
150mM Sucrose 750ul 2M
H 2 O 8141ul
Energy Mix:
150 mM creatine phosphate
20 mM ATP
2 mM EGTA
20 mM MgCl2
100 ul aliquots- store at -20 deg C.
