染色后发现 FITC 荧光全部在胞浆内是什么原因？如何进行实验步骤？

有的抗原收是膜抗原，比如说某些CD分子，但是，实验中发现，胞浆中也有，是不是因为该蛋白表达过程中，需要中胞浆转运到胞膜，所以，实验中发现胞浆中也有荧光

考虑是不是抗体清洗的步骤不彻底，以及拍片的时候电压调节是否合适。

首先，看下自己做的蛋白是否只定位在膜上，在你的细胞种类中表达量如何；第二，查下抗体说明书，看下给出的参考图，是否一抗特异性不行，或者抗体不适用于IF实验；第三，尽管大多数二抗会有背景，但相较于阳性信号，背景时很弱的。

第一，无一抗的阴性组胞浆也有信号，说明共聚焦或者荧光显微镜的参数调的不合适，要调到阴性组无信号才行。第二，膜上蛋白没有染出来，有可能抗体浓度不够，染色时，最好4℃过夜孵育抗体，既能减少非特异性结合，使背景干净，也能够使染色效果最好。最后洗涤抗体的时候用加了0.1%tween20的PBS洗涤，会使染色效果更好。

二抗的干扰～检查一下二抗是否合适～换个二抗

主要考虑封闭不好，抗体非特异性结合。建议选用合适的封闭液及封闭方式

1⃣️首先确认样品是否为单细胞层，是否存在其他细胞叠加的情况。 2⃣️确认固定及封闭过程是否无误。