如何最大限度地降低非特异性染色和背景着色？

产生原因： （1）游离荧光素残留在二抗中。一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。 （2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。 （3）组织抗原封闭不全。除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。 （4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。 （5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。 （6）荧光素不纯、标本固定不当等。 （7）一抗和二抗孵育条件和浓度不合适。 （8）一抗和二抗孵育后的清洗不充分。 消除方法： （1）购买高质量、高纯度的荧光素二抗。 （2）二抗配置时用透析法或层析法分离荧光素标记的二抗和游离的二抗。 （3）调整一抗和二抗孵育条件和浓度至最佳。 （4）增加清洗次数和延长清洗时间。 （5）延长血清封闭时间。 （6）适当稀释二抗浓度至出现特异性染色阳性，而非特异性染色保持阴性。