平淡EB8V
二次PCR或者直接连,现在重组酶效率很高,只要有产物就可以连上
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1、把切的两块或多块胶融化后,无论多大的体积都用一个管子,转移到同一个柱子上。
2 、溶胶时所加的溶液可多一点,这样更有利于DNA与膜的结合,不过一般不要多余750ul。
3、 胶回收的关键是通过柱子的溶液的盐浓度、酸碱性(电荷)和疏水性使DNA与柱子结合,因此,若电泳缓冲液的PH偏高,可在溶胶液中加入10ul(PH 5.0,3mol/L的 NaAC);为了使DNA分子更好的拦截在膜上,可以添加30%异丙醇在加热溶解胶后的液体里。
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提高胶回收量的办法:
1、 增加电泳时的上样量。
2、电泳缓冲液用新鲜配制的。
3、切胶时尽量只切有条带的胶,减小切胶体积:含目的片断很少的胶就不要要了,不然影响回收率。
4、把切的两块或多块胶融化后,无论多大的体积都用一个管子,转移到同一个柱子上。
5、 溶胶时所加的溶液可多一点,这样更有利于DNA与膜的结合,不过一般不要多余750ul。
6、 胶回收的关键是通过柱子的溶液的盐浓度、酸碱性(电荷)和疏水性使DNA与柱子结合,因此,若电泳缓冲液的PH偏高,可在溶胶液中加入10ul(PH 5.0,3mol/L的 NaAC);为了使DNA分子更好的拦截在膜上,可以添加30%异丙醇在加热溶解胶后的液体里。
7、 加洗脱液之前,将柱子在室温放置几分钟(大约需10分钟),以使乙醇充分挥发。
8、最后少加些洗脱液,尽量减少回收体积,一般用30-50μl洗脱液洗脱(不能太少,否则无法浸湿膜反而不利于洗脱);洗脱液滴在膜中央,以充分洗脱结合在膜上的DNA。
9、 可以在加入洗脱液之后,可以在55度水浴5分钟或放在50度水浴10分钟以上再洗脱,或用封口膜密封4度过夜,第二天再离心回收,效果不错。
10、将离心后的洗脱液加回吸附柱,再次离心。
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1、 增加电泳时的上样量。
2、电泳缓冲液用新鲜配制的。
3、切胶时尽量只切有条带的胶,减小切胶体积:含目的片断很少的胶就不要要了,不然影响回收率。想了解更多精彩内容,快来关注ELISA检测试剂盒抚生
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建议适当增加循环数来提高目的条带的浓度,或者适当延长在柱子上停留的时间或减少切胶体积等试试看。
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