如何用考马斯亮蓝检测蛋白质的浓度？

考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作

试剂：

1、 考马斯亮蓝试剂：

考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，雍蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。

2、 标准蛋白质溶液：

纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。

标准曲线制作：

试管编号 0 1 2 3 4 5 6

100ug/ml标准蛋白（ml） 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

0.15mol/L NaCl （ml） 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4

考马斯亮蓝试剂 （ml） 5 5 5 5 5 5 5

摇匀，1h内以1号管为空白对照,在595nm处比色

A595nm

以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。

1）、利用标准曲线查出回归方程。

2）、用公式计算回归方程。

3）、或用origin作图 ，测出回归线性方程。即A595nm=a×X( )+6

一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。

4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。

蛋白质含量的测定：

样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1操作，测出样品的A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。

一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算。

每毫升加入1微蛋白震荡摇匀后96空板检测，每孔200微求均值，检测595吸光度值根据标曲换算浓度。

实验操作：

制取不同浓度的标准蛋白溶液：可取普通洁净的试管7支，1号管取放0.1mL去离子水作为空白组，2-6号用微量移液器分别加入1.0mg/mL的BSA溶液0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mL，然后每管均用去离子水补充到0.1mL，另外7号试管取放待测蛋白溶液0.1mL，所有试管用涡旋混匀器充分混匀；

加入染色试剂：用移液器或者移液管向上述试管分别加入3.0mL考马斯亮蓝G250试剂，用涡旋混匀器轻轻快速混合均匀；

比色：考马斯亮蓝试剂与蛋白质结合速度快，2-5分钟即可完成，1小时内保持稳定，故可以在溶液静置5分钟后在分光光度计上测定各试管溶液在波长595nm处的光吸收值A595；

比色时使用的比色皿最好选用玻璃或者塑料比色皿，不要使用石英或者硅胶比色皿，因为考马斯亮蓝染料容易结合附着于石英或硅胶材料上，不易洗去染色。

比色完成后及时用水清洗，再用40%乙醇润洗，洗去颜色，最后再用水洗净。

如果使用的是塑料比色皿，乙醇润洗时间不宜过长，决不能在乙醇或者丙酮中长时间浸泡，因为那会导致塑料比色皿溶胀失真。

制作标准曲线：以标准蛋白溶液浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度值A595为纵坐标作图，可进行直线拟合，即可得到一条标准曲线；

计算待测蛋白质浓度：将分光光度计测出的待测蛋白质溶液的光吸收度A595值，对照标准曲线即可算出待测蛋白质浓度。

点成DEN-600光度计， 是一款紧凑、便携、可电池供电的光度计，可以方便地放置在生物安全柜、培养箱中，该设备可容纳10mm光程的标准比色皿、普通圆底试管或离心管等。USB连接和DEN软件可进行数据传输、数据处理和计算。600 nm波长光学系统设计可以进行如下测量：估算细胞总数（OD600）、浊度测量（McFarland单位）、蛋白质浓度测量（Bradford 蛋白质测定法）。分光光度计通常应用于这些领域，因此DEN-600可作为分光光度计的平价替代品。

考马斯亮蓝染色测蛋白浓度需制作标准曲线，根据595nm波长处比色，加入试剂后5-20min内测定光吸收值，然后计算绘制标准曲线，再根据标准曲线计算位置样品蛋白浓度，跟BCA试剂盒有点类似

考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg/mL，最小可测2.5μg/mL蛋白质，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法

测定结合染色后溶液在595nm处的光吸收度值来计算溶液中蛋白质的含量。

通过分光光度计先测定已知浓度的标准蛋白溶液染色后在波长595nm的吸光度A595并绘制标准曲线，然后测定同样染色后的待测蛋白溶液在波长595nm的吸光度值，根据标准曲线即可计算出待测蛋白质的浓度。

希望有用的

1)染料试剂 100mg考 马 斯 亮 蓝 G-250溶 解 在50ml 95%乙 醇，然 后 与100ml 85%磷酸混合，加入蒸馏水配成1L。棕色瓶中室温下可储存数周，使用前必须用滤纸过滤除去储存试剂中沉淀的染料。在常规蛋白测定中，对染料的品质无严格要求，考马斯亮蓝 G-250中可溶性染料的含量因来源和供应商不同变动很大，通常认为Serva蓝G 含量最高，往往用于改良测定法中。

(2)蛋白质标准在考马斯亮蓝法中，由于最常用的蛋白质标准牛血清蛋白与染料的反应偏大，导致测定的样品蛋白含量偏低。因此，选择标准蛋白质建立标准曲线时，尽量采用与待测样品蛋白相同的蛋白质，或者选用与染料结合能力接近于蛋白质平均值的牛γ球蛋白为蛋白质标准，以减小偏差。在 具 体 报 告 测定量时，必须说明所用的蛋白质标准。蒸馏水 配 置 牛 γ球 蛋 白 储 液，-20℃存 放。使用前用 280nm 下的吸光度测定标准溶液中精确的蛋白浓度，γ球 蛋 白A2801mg/ml（1cm光程）为1.35.

(3)检测器皿要求使用洁净无洗涤剂的塑料器皿或玻璃器皿，用甲醇或去污剂漂洗去除器皿上的染料痕迹。请勿使用石英、硅胶比色杯，因为染料会结合在此类材料上。

(4)检测方法有标准检测和微量检测两种分析类型，分 别 适 用 于 10-100μg蛋白质和1-10μg蛋白质的测定。由于检测试剂因存储时间会导致吸光度的变化，所以每次检测必须作标准曲线。

①样品稀释 吸取100μL蛋白样品稀释液 （100，10-1，10-2，10-3）双份。

②制备标准曲线吸取γ球蛋白储液 （标准检测中储液浓度1mg/ml，微量检测中储液浓度100μg/ml），分别取10μl、20μl、40μl、60μl、80μl、100μl各双份，用蒸馏水配成100μl，以蒸馏水为试剂空白。

③测定加入染料试剂 （加入量：标准检测5ml，微量检测1ml），混合均匀 （倒置翻转或轻轻振荡，避免气泡）。染料与蛋白质结合的过程只需要2min，复合物的颜色在1h内保持稳定 （5-20min内稳定性最好）。因此加入染料试剂2-60min内，测定各管的吸光度，不需要严格控制时间。

④计算标准曲线轻微非线性，在标准检 测 中，100μg γ-球 蛋 白 的 A595约 为0.4；在微量检测中，10μg γ-球蛋白的A595为0.45。根据待测样品的吸光度，从标准曲线上计算出样品蛋白质浓度。