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蛋白质的浓度测定

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8465

检查试管是否干燥、洁净,若否,则将其洗净并置于干燥箱内120℃烘干。

1.标准曲线的制作


取普通清洁试管7支,标号,1号管为空白,2~7管用微量注射器分别加1.0mg/mL的牛血清白蛋白(即标准蛋白质)溶液10,20,40,60,80,100mL。各管均用0.015mol/L PBS缓冲液补充到100mL(即0.1mL),详见表6-1。混匀待用。


表13-1标准曲线的制作
管号
标准蛋白质(mL)
缓冲液(mL)
总体积(mL)
1
0
100
100
2
10
90
100
3
20
80
100
4
40
60
100
5
60
40
100
6
80
20
100
7
100
0
100

2.将待测蛋白配成合适浓度


另取3支清洁试管,编号8、9、10,用微量注射器按表6-2操作,将待测蛋白配成系列浓度。

表13-2待测蛋白的稀释


管号
待测蛋白质(mL)
缓冲液(mL)
总体积(mL)
稀释倍数
8
20
80
100
5
9
40
60
100
2.5
10
60
40
100
1.67

3.加入G250试剂


各试管充分混匀后,用取样器分别加入5.0mL考马斯亮兰G250试剂,每加完一管,立即混合(注意不要太剧烈,以免产生大量气泡而难于消除)。

4.比色


各管室温静置2~5min后,在分光光度计上测定595nm处的光吸收值A 595 ,空白对照为第1号试管,标准和待测蛋白样同时比色。
注意:不可使用石英比色皿(因不易洗去染色),只能使用玻璃比色皿,使用后立即用少量95%的乙醇润洗,洗去颜色。

5.制作标准曲线


以标准蛋白质浓度(mg/mL)为横座标、吸光度值A 595 为纵座标作图,即得到一条标准曲线。

6.根据标准曲线计算待测蛋白浓度


在标准曲线上,根据测出的待测样品的A 595 值,查出试管中蛋白质浓度,再按照计算公式:
待测蛋白质的浓度(mg/mL)=查出的浓度×稀释倍数

计算出待测蛋白浓度。如样品稀释合理且操作得当,待测蛋白的三个数值应具有同一性,取其平均值作为待测蛋白浓度。如某一光吸收值落在标准曲线线性范围外,舍弃该点。

 
计算
管号
标准蛋白质(mL )
缓冲液(mL )
G-250试剂(mL)
每管中的蛋白质浓度(mg/mL)
光吸收值(A 595 )
1
0
100
5
0
2
10
90
5
0.1
3
20
80
5
0.2
4
40
60
5
0.4
5
60
40
5
0.6
6
80
20
5
0.8
7
100
0
5
1.0
管号
待测蛋白质(mL )
缓冲液(mL )
G250试剂(mL)
A 595
查出的浓度(mg/mL)
稀释倍数
待测蛋白质浓度(mg/mL)
待测蛋白
8
20
80
5
5

9
40
60
5
2.5

10
60
40
5
1.67

结果:待测蛋白质的浓度为: mg/mL
(责任编辑:大汉昆仑王)

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