[咨询]纯化线粒体的ATP浓度测定

碧云天使用说明：

1. 样品测定的准备：

对于贴壁细胞：

吸除培养液，按照6孔板每孔加入200微升裂解液的比例加入裂解液，裂解细胞。裂解细胞时为了裂解充分，可以使用移液器进行反复吹打或晃动培养板使裂解液充分接触并裂解细胞。通常细胞在接触裂解液后会立即裂解。裂解后4℃ 12000g离心5分钟，取上清，用于后续的测定。

对于悬浮细胞：

用离心管离心沉淀细胞，弃上清，轻轻弹散细胞，按照6孔板每孔的细胞量加入200微升裂解液的比例加入裂解液，裂解细胞。裂解细胞时为了裂解充分可以弹击离心管管底或适当Vortex使裂解液充分接触并裂解细胞。

对于组织样品：

按照每20毫克组织加入约100-200微升裂解液的比例加入裂解液，然后用玻璃匀浆器或其它匀浆设备进行匀浆。充分匀浆可以确保组织被完全裂解。裂解后4℃ 12000g离心5分钟，取上清，用于后续的测定。

2. 标准曲线测定的准备：

冰浴上融解待用试剂，把ATP标准溶液用ATP检测裂解液稀释成适当的浓度梯度。具体的浓度需根据样品中ATP的浓度而定。初次检测可以检测0.01、0.03、0.1、0.3、1、3和10μM这几个浓度，在后续的实验中，可以根据样品中ATP的浓度对标准品的浓度范围进行适当调整。

3. ATP检测工作液的配制：

按照每个样品或标准品需100微升ATP检测工作液的比例配制适当量的ATP检测工作液。把待用试剂在冰浴上融解。取适量的ATP检测试剂，按照1:9的比例用ATP检测试剂稀释液稀释ATP检测试剂。例如100微升ATP检测试剂加入900微升ATP检测试剂稀释液配制成1毫升ATP检测工作液。稀释后的ATP检测试剂即为用于后续实验的ATP检测工作液。ATP检测工作液可在冰浴上暂时保存。

4. ATP浓度的测定：

a. 加100微升ATP检测工作液到检测孔或检测管内。室温放置3-5分钟，以使本底性的ATP全部被消耗掉，从而降低本底。可以一次性把10-20个检测孔或检测管分别加上100微升ATP检测工作液，从而节省时间。

b. 在检测孔或检测管内加上20微升样品或标准品，迅速用枪混匀，至少间隔2秒后，用化学发光仪或液闪仪测定RLU值或CPM。

c. 根据标准曲线计算出样品中ATP的浓度。

d. 为了消除样品制备时由于蛋白量的差异而造成的误差，可以用碧云天生产的BCA蛋白浓度测定试剂测定样品中的蛋白浓度。然后把ATP的浓度换算成nmol/mg蛋白的形式。

碧云天ATP试剂盒进行纯化线粒体测定是需要进行裂解的。