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请问蛋白质组学研究主要有哪些技术手段?主要的优缺点有哪些?

相关实验:质谱在蛋白质组学中的应用实验

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dxy_2zf2ycg2

1、主要是哪些质谱手段?基本原理是什么?

2、各自的优缺点有哪些?


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8 个回答

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高山云初

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主要分为四大类:第一类是凝胶和非凝胶的蛋白质组分离技术;第二类是基于生物质谱技术的蛋白质组学鉴定技术;第三类是蛋白质组学定量技术;第四类是基于生物信息学的蛋白质组学数据的分析处理技术。

优缺点

1. 蛋白质组学分离技术

目前蛋白质组学常用的分离技术主要有两种类型:一是凝胶技术,主要包括双向凝胶电泳(Two-dimensional electrophoresis,2-DE)技术以及后来出现的双向荧光差异凝胶电泳技术(Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis,2D-DIGE);二是非凝胶技术,主要是色谱(Liquid Chromatography,LC )技术,尤其是高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)和多维液相色谱(Multi-Dimensional Liquid Chromatography,MDLC)。

1.1双向凝胶电泳

第一向为等电聚焦(Isoelectrofocusing,IEF):使蛋白质根据等电点不同进行分离,第二向为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE):将等电聚焦后的胶条放在SDS-PAGE上再根据蛋白质分子量不同进行电泳分离。由于具有高分辨率的特点,双向凝胶电泳在蛋白质组学的研究当中始终占据着重要的地位。现在的双向凝胶电泳技术第一向利用固相pH梯度(Immobilized pH Gradient,IPG)等电聚焦技术,具有上样量大、分辨率高、重复性好等优点,并且可以提供蛋白质的等电点(pI)和分子量(MW)数值信息,有助于蛋白质的鉴定,而且双向凝胶电泳胶上常见的isoform多是蛋白质翻译后修饰的结果,对于这些蛋白质点的分析有助于了解对蛋白质功能影响重大的翻译后修饰。

双向凝胶电泳技术也存在一些缺陷,一,双向凝胶电泳对蛋白质的分离受到蛋白质丰度、等电点、分子量和疏水性等的限制。对于低丰度蛋白质,由于上样量的限制不能达到足够质谱鉴定需要的量;对于极大蛋白质(相对分子质量>200 kDa)、极小蛋白质(相对分子质量<8 kDa)、极碱性蛋白质和疏水性蛋白质(膜结合蛋白质和跨膜蛋白质),都难以进行有效分离分析。二,双向凝胶电泳操作费时费力,难以实现和质谱的直接联用,不易自动化。

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huarenqiang5

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蛋白质组学研究方法有如下几种:

一、双向凝胶电泳(2-DE)


双向凝胶电泳(2-DE)是蛋白质组学研究中最早、最常用的分离技术。它将蛋白质混合物在第一向基于等电点进行分离,然后在第二向基于分子量进行分离,并将分离后的蛋白质通过染料染色或者放射自显影等技术进行检测和鉴定。2-DE能够分离的蛋白质范围广,分辨率和重复性好,但是对蛋白质的溶解度、分子量、等电点等性质有要求,因此存在一定的局限性。

二、基于液相色谱的分离技术


液相色谱(LC-MS/MS)是近年来发展最为迅速的蛋白质组学技术。它采用液相色谱分离蛋白质,然后通过质谱技术进行检测和鉴定。LC-MS/MS具有高分辨率、高通量、高灵敏度等优点,已经成为蛋白质组学研究的主流技术之一。常用的液相色谱技术包括反相液相色谱、离子交换液相色谱、尺寸排阻色谱等。


三、质谱技术


质谱技术是蛋白质组学研究中不可或缺的一部分。它能够提供蛋白质的分子量、序列、修饰等信息,对于蛋白质的鉴定和序列分析具有重要作用。常见的质谱技术包括 MALDI-TOF、ESI-MS、nano-LC-MS/MS 等。其中,nano-LC-MS/MS具有高通量、高灵敏度、高分辨率等优点,已经成为蛋白质组学研究中最为常用的质谱技术之一。


四、蛋白质相互作用分析


蛋白质相互作用分析是蛋白质组学研究中的另一个重要方向。它能够揭示蛋白质之间的相互作用关系,进而探究蛋白质的功能及其调控机制。常见的蛋白质相互作用分析技术包括免疫共沉淀、酵母双杂交、荧光共振能量转移等。其中,荧光共振能量转移技术具有高灵敏度、高分辨率等优点,已经成为研究蛋白质相互作用的主流技术之一。

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静心观照

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1、双向凝胶电泳:双向凝胶电泳的原理是一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离,第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离,把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。它可用于蛋白质转录及转录后修饰研究,蛋白质组的比较和蛋白质间的相互作用,细胞分化凋亡研究,致病机制及耐药机制的研究,疗效监测,新药开发等许多方面。

2、等电聚焦:等电聚焦是利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。等电聚焦凝胶电泳依据蛋白质分子的静电荷或等电点进行分离,等电聚焦中,蛋白质分子在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳定的线性pH梯度中电泳。载体两性电解质是脂肪族多氨基多羧酸,在电场中形成正极为酸性,负极为碱性的连续的pH梯度。蛋白质分子在偏离其等电点的pH条件下带有电荷,因此可以在电场中移动;当蛋白质迁移至其等电点位置时,其静电荷数为零,在电场中不再移动,据此分离蛋白质。

3、生物质谱:其基本原理是样品分子离子化后,根据不同离子之间的荷质比的差异来分离并确定分子量。对于经过双向电泳分离的目标蛋白质用胰蛋白酶酶解(水解Lys或Arg的-C端形成的肽键)成肽段,对这些肽段用质谱进行鉴定与分析。包括基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和电喷雾质谱(ESI- MS)。

  飞行时间质谱:原理是将分析物分散在基质分子(尼古丁酸及其同系物)中并形成晶体,当用激光(337nm的氮激光)照射晶体时,基质分子吸收激光能量,样品解吸附,基质-样品之间发生电荷转移使样品分子电离。它从固相标本中产生离子,并在飞行管中测定其分子量,MALDI-TOF-MS一般用于肽质量指纹图谱,非常快速(每次分析只需3~5min),灵敏(达到fmol水平),可以精确测量肽段质量,但是如果在分析前不修饰肽段,MALDI-TOF-MS不能给出肽片段的序列。

  电喷雾质谱:是利用高电场使质谱进样端的毛细管柱流出的液滴带电,在N2气流的作用下,液滴溶剂蒸发,表面积缩小,表面电荷密度不断增加,直至产生的库仑力与液滴表面张力达到雷利极限,液滴爆裂为带电的子液滴,这一过程不断重复使终的液滴非常细小呈喷雾状,这时液滴表面的电场非常强大,使分析物离子化并以带单电荷或多电荷的离子形式进入质量分析器。ESI-MS从液相中产生离子,肽段的混合物经过液相色谱分离后,经过偶联的与在线连接的离子阱质谱分析,给出肽片段的精确的氨基酸序列。

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沫子大大

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蛋白质组学研究主要有以下几种技术手段:

 

蛋白质分离技术:包括凝胶电泳、液相色谱、等电聚焦等。这些技术可以将样品中的蛋白质分离并提取出来,为后续质谱分析提供样品。

 

质谱技术:包括液相色谱质谱联用(LC-MS/MS)、表面增强激光解吸电离质谱(SELDI-TOF-MS)、基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-TOF-MS)等。这些技术可以对蛋白质进行分析,得到蛋白质的质量、序列、修饰和结构等信息。

 

生物信息学技术:包括蛋白质质谱数据处理、生物信息学数据库查询、生物信息学分析、蛋白质互作网络分析等。这些技术可以对质谱数据进行处理和分析,进一步研究蛋白质的功能和调控机制。

 

不同的技术手段具有不同的优缺点:

 

凝胶电泳:简单易行、成本低、可同时分离多种蛋白质,但分离效果受蛋白质性质影响大,无法分离大分子蛋白质。

 

液相色谱:分离效果好、可同时分离多种蛋白质、可在线联用质谱,但需要较长的分离时间、成本较高。

 

SELDI-TOF-MS:高通量、快速、适用于大样本量分析,但对样品的制备和处理要求高,存在信号峰重叠等问题。

 

MALDI-TOF-MS:高灵敏度、高分辨率、不需要分离纯化,但只适用于小分子质量分析,对样品制备和分析条件要求较高。

 

LC-MS/MS:可鉴定和定量多种蛋白质、高灵敏度、高分辨率,但需要较长的分离时间、成本较高。

 

生物信息学技术:可以对大量的质谱数据进行处理和分析,可以帮助鉴定蛋白质、预测蛋白质结构和功能,但需要较高的计算能力和生物信息学知识。

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dxy_mqg1dtg8

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蛋白质组学研究主要有以下技术手段:

1. 二维凝胶电泳(2D-PAGE):是一种常用的蛋白质分离技术,可将复杂的蛋白质混合物分离成单个蛋白质斑点,进而用于定量和鉴定。优点是可以对复杂样品进行高分辨率分离,但是需要大量的样品和时间,并且不能很好地分离高分子量或低丰度的蛋白质。

2. 质谱(Mass Spectrometry):通过将蛋白质分子离子化并加速,使其进入质谱仪进行分析,从而得到蛋白质的质量和序列信息。质谱技术可以高通量地鉴定和定量蛋白质,但是需要高质量的蛋白质样品和复杂的分析流程。

3. 蛋白质芯片技术:利用微阵列技术制备出蛋白质芯片,在芯片上固定一系列蛋白质,用于检测样品中与这些蛋白质相互作用的分子。蛋白质芯片技术具有高通量、高灵敏度和高选择性等优点。

4. 蛋白质组学数据分析:包括生物信息学、机器学习、人工智能等方法,用于处理和分析大规模蛋白质组学数据,从而挖掘出生物学上的重要信息和新的研究方向。

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粥辰辰辰辰

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蛋白质组学(proteomics)主要内容是以系统生物学的思路构建蛋白质组学技术策略与各种功能基因组学技术、临床试验诊断与治疗技术相结合的全新技术平台、在疾病的预防、早期诊断和治疗等方面推进基础医学与临床医学的结合,以期在人类重要疾病的预防方面取得重大突破。

(1)临床蛋白质组学是将蛋白质组学技术应用于临床医学研究,它主要围绕疾病的预防、早期诊断和治疗等方面开展研究,其中恶性肿瘤是临床蛋白质组学研究的一个重点研究对象。

(2)临床蛋白质组学是蛋白质组学新近出现的一个分支学科,它侧重蛋白质组学技术在临床医学领域的应用研究,并围绕着疾病的预防、早期诊断和治疗等方面开展研究;主要包括以下几个方面: 疾病动物模型的蛋白质组学研究、 寻找疾病的生物标志物,通过对疾病相关功能蛋白质进行定性、定量和表征研究,深入了解这些蛋白质的结构和功能,揭示疾病过程中细胞内全部蛋白质的运动活动规律,为疾病发生、发展机制机理的阐明和早期诊断及治疗提供理论依据和解决途径。

尽管双向凝胶电泳在蛋白质组研究中已被广泛应用,但这种方法还存在,通过双向凝胶电泳分离的蛋白点不一定只代表一种蛋白.

双向电泳的通量、灵敏度和规模化均有待于进一步加强。二维凝胶电泳有分离容量的先天限制,染色转移等环节操作困难费时,低峰度蛋白难以辨别,和质谱技术的连用已成为瓶颈。

蛋白质是机体生理、病理活动功能的直接执行者,对于它的性质和数量变化的精确把握是揭示机体生理变化和疾病病因、发病机制的重要切入点。与传统的单一蛋白质研究方法相比,组学技术可大大提高诊断的敏感性和特异性,蛋白质组学的这一技术特点无疑在医学研究中具有不可替代的优势,它可以跟踪机体最细微的生理病理变化,通过对疾病特异性蛋白质的寻找,使疾病的早期诊断成为可能。蛋白质组学技术为正常生理研究、疾病诊断,尤其是早期诊断方面提供了广阔的技术平台,在指导治疗和判断预后等方面具有巨大发挥空间,临床样本都是各种细胞或组织混杂,状态不一,病变组织与正常组织的差异比较,往往是多种细胞甚至组织蛋白质组混合物的比较,而蛋白质组研究需要的通常是单一的细胞类型;质谱技术是目前蛋白质组研究中发展最快,也最具活力和潜力的技术,对于蛋白质鉴定而言,高通量、高灵敏度和高精度是三个关键指标,但一般的质谱技术却难以将三者合一;双向凝胶电泳是分离蛋白质的有效手段,但做过的人一定会抱怨它的繁琐、不稳定和低灵敏度等缺点。

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小小小小小芳

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为探究生物进程的分子机制,需要确定介导这个过程的蛋白质-蛋白质间的相互作用。研究蛋白质间相互作用的主要技术总结如下:


一、酵母双杂交系统


酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后,诱饵蛋白结合于报道基因的启动子,启动报道基因在酵母细胞内的表达,如果检测到报道基因的表达产物,则说明两者之间有相互作用,反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中,人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能,丰富了酵母双杂交系统的功能。此外,酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。


二、噬茵体展示技术


在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列,当噬菌体生长时,表面就表达出相应的单抗,再将噬菌体过柱,柱上若含目的蛋白,就会与相应抗体特异性结合,这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用,不仅有高通量及简便的特点,还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前,用优化的噬菌体展示技术,已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库,并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。


三、等离子共振技术


表面等离子共振技术(SurfacePlasmonResonance,SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”,当待测蛋白与诱饵蛋白结合后,薄膜的共振性质会发生改变,通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料,反应过程可实时监控。测定快速且安全,还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。

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小小翻车鱼

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蛋白质组学研究主要涉及蛋白质的分离、鉴定和分析。主要的技术手段有以下几种:


1. 二维电泳(2D-PAGE):二维电泳是一种在两个方向上对蛋白质进行分离的技术,包括等电聚焦(IEF)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。二维电泳能够有效地分离成千上万种蛋白质,分辨率较高。然而,其通量较低,分析速度慢。


2. 液相色谱(HPLC):液相色谱是一种高效的分离技术,可对蛋白质和肽段进行分离。其分析速度较快,适用于大规模蛋白质组学研究。然而,其分辨率和重复性相对较低。


3. 质谱技术:


a) 基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS):MALDI-TOF MS是一种软电离技术,适用于肽质量和序列分析。其分析速度快,但分辨率和准确度相对较低。


b) 电喷雾离子源质谱(ESI-MS):ESI-MS是一种硬电离技术,适用于蛋白质和肽段的定量分析。其分辨率和准确度较高,但分析速度相对较慢。


c) 液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS):LC-MS/MS是一种将HPLC与MS联用的技术,可实现蛋白质和肽段的高灵敏度和高准确度分析。其分辨率和准确度较高,但分析成本也相对较高。


蛋白质组学研究主要使用MALDI-TOF MS、ESI-MS和LC-MS/MS这三种质谱技术。它们的基本原理是通过质谱分析蛋白质和肽段的分子量和序列信息,从而进行蛋白质鉴定和定量。每种质谱技术都有其优缺点,如分析速度、分辨率、准确度和成本等。在实际研究中,需要根据实验目的、样品特性和分析需求选择合适的质谱技术。

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