AAV病毒用于细胞实验需要注意哪些问题？

AAV病毒用于细胞实验关键注意事项

1. 启动子的选择。是选择广泛性启动子还是特异性启动子。相比于血清型的组织特异性，特异性启动子可实现细胞的特异性，因此对特异性要求较高的研究，可以选择某种细胞特异性表达的启动子。

2. 血清型的选择。AAV的血清型主要由AAV衣壳蛋白的结构所决定，不同的衣壳蛋白结构识别不同的细胞表面受体，因此血清型的选择会影响AAV的感染效率、组织亲和性、和开始表达的时间。

3. 病毒量及滴度。根据不同的靶器官组织和所使用的不同AAV血清型（扩散能力不同），推荐注射的AAV量不同，传递到组织中的病毒颗粒数量对于感染效果影响很大。但AAV使用量并不是越多越好，过多的量可能出现病毒溢出，而且根据我们的经验，病毒量太多有时候甚至会出现表达降低的情况。想了解具体组织的病毒用量可以联系我们咨询。

4. 注射方式。对于可以进行局部注射的组织器官，采用局部多点注射靶器官可取得较好的特异性和表达效果；

5. 检测时间。不同基因的表达高峰时间是不同的，再加上AAV需要从单链DNA变成双链DNA，一般在2周可检测到基因表达，如无抗体产生的影响，基因的表达可持续表达半年以上。

虽然 AAV 病毒比其他多数病毒稳定（如慢病毒），但是也请避免反复冻融，否则将会导致病毒滴度显著下降。

1. 病毒使用前，操作人员应当充分了解病毒相关实验安全问题，加强安全操作意识。在实验操

作中，请务必穿戴好实验服、口罩、护目镜以及一次性手套。

2. 建议按照 BSL-2（Biosafety Level-2，生物安全防护二级水平）规范在 Class II 生物安全

柜中进行病毒操作（如在超净工作台中进行操作，请勿打开排风机，避免病毒与外界环境接触）。

3. 病毒操作时，请注意避免蛋白酶或细菌污染，请使用 DNase/RNase-Free 耗材进行操作。

4. 若眼睛、皮肤等不小心接触到病毒，请立即用大量清水冲洗；若病毒接触到伤口等部位，请

立即用 10% 碘伏溶液擦洗之后，用大量清水冲洗，冲洗时间建议至少 20min。

5. 实验结束后，请用新配制的 1% 的次氯酸钠溶液消杀病毒至少 20min；也可采用 2% 的戊二

醛溶液或 0.25% 的 SDS 溶液进行消杀处理，还可采用高温高压（121℃，1h）消杀措施。

AAV做体外实验表达水平较低，主要因为常用的AAV病毒基因组是单链DNA，需要先复制成双链再转录翻译。AAV感染细胞后对细胞的分裂能力影响小，体外培养的细胞相对体内细胞分裂快，随着细胞分裂，细胞中的AAV呗稀释，也导致细胞实验中表达效率不高。

用AAV感染细胞时需要设置较高的moi值，这个值通常需要10^5vg/cell甚至更高，需要在正式实验前设置滴度进行摸索。