有没有做过cell free表达蛋白的大神！

无细胞技术（cell-free）蛋白质表达上的应用，作为近年来单独列出的蛋白表达系统，主要用于表达膜蛋白等难以在细胞内获取的蛋白。膜蛋白在细胞间联系、表面识别、细胞骨架接触、信号传导、酶活性及物质运输中扮演了重要角色。由于其具有多种细胞功能，膜蛋白是非常理想的药物靶标。但是，膜蛋白的其复杂的优化过程使得纯化非常困难并且耗费时间。无细胞技术可以用来来获得高得率的可溶性的膜蛋白。在无细胞技术 无细胞技术（cell-free）膜蛋白时，有时候会加入Nanodisc（纳米磷脂盘），获得稳定的蛋白质，其应用范围包括生物物理学分析、表面等离子共振、核磁共振和冷冻电镜的质谱分析。

Nanodiscs可使膜蛋白处于一个类似磷脂双分子层的环境中，从而保证膜蛋白能够像在天然的细胞膜中维持其构象和生物学功能。Nanodisc能够很好地维持膜蛋白的稳定，从而可以在膜蛋白领域的研究工作起到很大的作用。Nanodisc是由膜支架蛋白(membrane scaffold proteins，MSPs)和磷脂分子构成的磷脂双分子层类膜结构。

根据不同的实验情况，多数时候可以使用两种不同的方法来包裹其想要获得的膜蛋白：

1） 对于已经分离并溶解在去污剂中的膜蛋白，我们推荐使用膜支架蛋白（MSPS）并配合磷脂分子使用。

2） 针对无细胞表达系统所生产的膜蛋白，推荐使用空载并已经组装好的纳米磷脂盘来包裹/插入其目标膜蛋白。

无细胞蛋白合成系统（cell-free protein synthesis system），也叫做体外（in vitro）蛋白表达系统，本系统中包含转录、翻译的全部元件，如T7 RNA聚合酶、核糖体，折叠元件等，加上核酸模板（DNA或者mRNA），无需活细胞即可以进行蛋白合成（图1）。

一、无细胞蛋白合成系统优势：

1. 特异性好：只有目标蛋白才会被合成，合成产物无需进行复杂的纯化步骤。

2. 不含核酸酶和蛋白酶。

3. 省时间，操作简单：

1）无需细胞的转化，培养和诱导；

2）适用于质粒和PCR扩增合成的线状DNA模板；

4. 克服蛋白毒性：即使对宿主细胞有毒性的蛋白也可以顺利合成。

5. 系统灵活性：

1）.可对合成系统进行个性化调整：自行添加chaperones，去垢剂，修饰酶等其他添加物；

2）·可实现高通量的模板和合成条件的筛选，大大节省时间和精力。

您可以检查以下几个可能的问题：

DNA 模板的质量：确保 DNA 模板是完整、纯净的，没有受到污染或降解的影响。建议使用质量较高的 DNA 制备技术，如商业化 DNA 制备服务或基于硅胶柱纯化的 DNA 提取。

反应体系的完整性：检查 cell-free 表达体系是否完整，包括底物、缓冲液、酶等。确保反应液体系中的每个组分都已正确添加，并且在合适的浓度下。

反应条件的优化：考虑对反应条件进行优化，例如反应温度、时间、盐浓度、pH 值等。这可以通过一系列实验来确定，例如反应时间和温度的梯度测试等。

蛋白表达的检测方法：确保您使用敏感的蛋白表达检测方法来检测您的蛋白质。例如，使用 Western blot、SDS-PAGE、质谱等方法来检测表达的蛋白质。

移除抑制剂：如果您的反应体系中存在可能抑制蛋白质表达的物质，例如 EDTA、肝素、抗生素等，建议将其移除或调整浓度。

切换表达体系：如果您无法在当前体系中表达蛋白质，您可以尝试使用其他的 cell-free 表达体系，例如 E. coli、小鼠乳腺癌细胞系等。

这些都是可能导致 cell-free 表达失败的一些常见问题和可能的解决方法，希望能对您有所帮助。