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脱硫生物素标记蛋白质的操作方法?

相关实验:蛋白质稳定性的保持

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dxy_2q47cbfq

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2 个回答

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毛利小五郎的徒弟

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脱硫生物素标记蛋白质的操作方法

工具/原料

• 10ul,50ul,200ul,1000ul可调高精度移液器

• 恒温箱(37℃)

• 离心机(离心力可达到12,000×g)

• 生物素标记试剂盒

实验前准备

  1. 仔细阅读使用说明书。

2.计算待使用NH2-Reactive Biotin的量。

3.提前20min从冰箱中取出试剂盒,平衡至室温(注:不需要用到的NH2-Reactive Biotin继续放置冰箱中)。

4.溶解NH2-Reactive Biotin:加入30ulDMF至NH2-ReactiveBiotin瓶中,静置10min,待其充分溶解,此时生物素的浓度为10mM。

操作步骤:(本操作步骤按照1mg的量进行标记)

1.取1mg待标记抗体于Filtration tube中,并加入相应体积的Labeling Buffer,使抗体的终浓度为2mg/ml,12,000 x g离心10min。(注:①Filtration tube的最大体积为0.5ml②待标记抗体浓度低时,可先超滤离心一次)

2. 加入13.3ul NH2-Reactive Biotin 和适量Labeling Buffer至上述Filtration tube中,使终体积为0.5ml,并轻轻吹打混匀。放入37℃恒温箱中避光温育30min。12,000 x g离心10min。

3. 加入适量Labeling Buffer至上述Filtration tube中,使终体积为0.5ml,并轻轻吹打混匀,12,000 x g离心10min。

4. 操作3重复一次。

5. 加0.2ml Labeling Buffer至Filtration tube中,轻轻吹打。将滤芯倒转放置于另一个离心管中,6,000 x g离心10min。

6. 收集离心管中的溶液,即为生物素标记的抗体。

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Dr_劉医生

有帮助

生物素标记蛋白操作方法:

1. 溶解2~10 mg 蛋白于1 ml 的BuphTm磷酸盐缓冲液中,并计算溶解的毫摩尔数。如果蛋白含有不恰当的缓冲液(如Tris或者甘氨酸),可以通过在PBS中透析或浓缩的方法除去。计算:蛋白质量(mg)/蛋白分子量(MW)=蛋白质的毫摩尔数。

2. 在打开之前,平衡生物素至室温。加2 mg Sulfo-NHS-Biotin于100 ul 超纯水中,加入足够量浓度的生物素,一般对于10 mg/ml 蛋白来说超过12倍分子数,对于2 mg/ml 蛋白溶液应超过20倍,或者该试剂也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中

3. 室温30分钟,或冰上放置2小时。

4. 用30 ml PBS预洗纯化柱,上样,加入与欲收集量相同的缓冲液,收集0.5 ml 或1 ml 于单独的管中。

5. 以280 nm 的吸收值测定蛋白含量。

6. 生物素化的蛋白4℃存放至使用,可加入叠氮钠、甘油等保存。
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