毛利小五郎的徒弟
工具/原料
• 10ul,50ul,200ul,1000ul可调高精度移液器
• 恒温箱(37℃)
• 离心机(离心力可达到12,000×g)
• 生物素标记试剂盒
实验前准备
仔细阅读使用说明书。
2.计算待使用NH2-Reactive Biotin的量。
3.提前20min从冰箱中取出试剂盒,平衡至室温(注:不需要用到的NH2-Reactive Biotin继续放置冰箱中)。
4.溶解NH2-Reactive Biotin:加入30ulDMF至NH2-ReactiveBiotin瓶中,静置10min,待其充分溶解,此时生物素的浓度为10mM。
操作步骤:(本操作步骤按照1mg的量进行标记)
1.取1mg待标记抗体于Filtration tube中,并加入相应体积的Labeling Buffer,使抗体的终浓度为2mg/ml,12,000 x g离心10min。(注:①Filtration tube的最大体积为0.5ml②待标记抗体浓度低时,可先超滤离心一次)
2. 加入13.3ul NH2-Reactive Biotin 和适量Labeling Buffer至上述Filtration tube中,使终体积为0.5ml,并轻轻吹打混匀。放入37℃恒温箱中避光温育30min。12,000 x g离心10min。
3. 加入适量Labeling Buffer至上述Filtration tube中,使终体积为0.5ml,并轻轻吹打混匀,12,000 x g离心10min。
4. 操作3重复一次。
5. 加0.2ml Labeling Buffer至Filtration tube中,轻轻吹打。将滤芯倒转放置于另一个离心管中,6,000 x g离心10min。
6. 收集离心管中的溶液,即为生物素标记的抗体。
Dr_劉医生
1. 溶解2~10 mg 蛋白于1 ml 的BuphTm磷酸盐缓冲液中,并计算溶解的毫摩尔数。如果蛋白含有不恰当的缓冲液(如Tris或者甘氨酸),可以通过在PBS中透析或浓缩的方法除去。计算:蛋白质量(mg)/蛋白分子量(MW)=蛋白质的毫摩尔数。