怎样提高Western Blot 的转膜效率？

浸泡PVDF膜5-10分钟，或者增加转膜时间，一定要注意散热，这很关键，冰融化了要及时更换。

一定要戴手套或镊子接触膜，推荐使用碧云天镊子，避免手上的蛋白和油脂降低转膜效率。

1、 Transfer buffer一定要配制正确，并且务必要分清running buffer 和transfer buffer。一个简便区分办法，transfer buffer里没有SDS，转膜时没有气泡。

2、转膜时务必要夹紧夹板，可采用“三明治”型滤纸加绵结构，要拧紧一点。可以增加海绵的厚度，也可以多加两块海绵，但是多加滤纸的时候要小心，因为不同滤纸的质地和材质不一样，可能会导致电阻比较大，需要延长转膜时间才可以(这个需要前期摸索)。

3、夹三明治转膜结构的时候可以多加transfer buffer，要没过胶和膜，这样有助于减少气泡，提高转膜效率。

4、注意转膜温度的控制。转膜过程中，尤其是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，需要在转膜盒外围加冰（冰不能融化过多），保证转膜的时候transfer buffer不发烫。

5、配置转膜液的时候，记住甲醇浓度20%，嫌甲醇危险的话也可以用乙醇。

6、胶在负极，膜靠近正极；转膜的时候，海绵要比滤纸大，滤纸要比胶块大，PVDF膜或硝酸纤维素NC膜要比胶块大，但都不要超过海绵；比对胶块中上样顺序，在膜上做好标记，便于后续分析结果。蛋白小的话,例如12KD，可以使用更薄的PVDF膜，或者减少转膜时间，80v,15min。

7、注意一定要戴手套或塑料镊子接触膜，避免手上的蛋白干扰蛋白或者油脂降低转膜效率。

8、对于湿转法：一般转膜的电流在200mA-400 mA之间，转膜时间为30-60 分钟。也可以在15-20 mA电流中转膜过夜。大片段的>50 KD的可以选用350 mA电流，小片段的可以用250 mA。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。

提高wb转膜效率方法：转移缓冲液加SDS（终浓度0.1%）；提高转移电压/电流；增加转移时间

1、湿转蛋白分子量范围较宽，在Western Blot实验中，常用的是湿转

2、选择合适的 PVDF膜，它在机械强度和化学相容性上都具有更优越的性能，且灵敏度高、分辨率和蛋白亲和力较其他的膜要高，非常适合分子量较小的蛋白质检测

注意事项：

1、注意一定要戴手套或镊子接触膜，推荐使用碧云天镊子，避免手上的蛋白和油脂降低转膜效率。 2、Western Blot中夹取PVDF膜最好使用平头镊子，并夹住膜左上角，可最大程度减小对膜上蛋白的损害。

3、湿转时，对胶、膜和滤纸的大小没有要求。半干转时，注意滤纸可以比胶或者膜稍小一些，否则上下层滤纸之间接触，易造成短路。

4、滤纸的主要作用是起支持作用，可根据自己的实验设备选择合适的滤纸数量。只要合上夹子时不会过紧或过松即可。

5、转膜时转膜液的温度、凝胶的参数(如数量、厚度、离子浓度、丙烯酰胺浓度等)、滤纸的厚度、同时使用的转膜槽数量、转膜液的离子浓度、转膜液的体积、转膜液使用的次数等都可能会影响电流和电压。电泳同时使用的转膜槽数量是最关键因素，如果是恒流，每增加一个转膜槽，每个槽的电流和电压都会相应减少一份。如果需要同时使用2个或以上的转膜槽，建议使用高电流的大功率电源，或者设定较低的电流或电压进行比较长时间的转膜。