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coip的对照相关的问题

相关实验:免疫共沉淀(Co-IP)

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丁香实验

如图,B分子量是50kd,A是180左右,IgG条带很明显,input几乎没有条带,这是为什么?(洗涤的时候都是洗了3遍),如何解决?

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25 个回答

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是小杨同学

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我觉得可能是input的浓度有点低了呢,或者是抗体的问题,如果是抗体的话可以跑wb去验证一下
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JCorona

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可能是上样量不够,适当增多上样量,或者先跑个WB看看浓度。
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dxyhsx123

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两方面。其一input的样本上样量和浓度是不是过少,其二,抗体是否合适。
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lzy必有我师

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把input占裂解液的比例和ip的样品占elute的比例调成一样,这样你就会发现input只是点少了。
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医往情深丁香园

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亲和也没问题,可以试一下先把input上个梯度做个wb看一下,再确定实验组的上样量。
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dxy_bq4uxnd

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input没有条带,可能是一抗不适合做co-ip,根本没有拉下东西,那么后面的条带就都应该是非特异的条带。
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dxy_qkedgrg7

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input浓度会不会太低了?IgG浓度太高,一起显就显不出来了,让input的蛋白跑个wb看看
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一支肾上腺素

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首先要排除你的IP条带不是IgG的重链和轻链,再者排除你的一抗或者二抗没有污染,一般我们用新配的抗体理论上说IP的条带要和Input的一样。
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内科小护士

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加入的A蛋白抗体和IgG 抗体,在最后一步的煮样中,被β巯基乙醇破坏了结构,变成了重链和轻链,随后由于A蛋白抗体和你的B蛋白抗体种属来源相同,又被你的B蛋白抗体识别出来,所以显影就出现了条带。
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dxy_h7vcp8v3

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input 没有条带,检查是否自己加样进入之后,是否混匀取样,是否只取到了上清而没有取到蛋白样😭 检查自己的上样量;其次input加入后应该取样,不用进行洗,如果洗,检查自己用的盐离子浓度是否太大。
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ZZDX-YILILI

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1.确定下B抗体是否完全适合做COIP. 2.做COIP时,B抗体投入的浓度是否按照说明书或者前期摸索过合适的浓度。
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dxywode

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B分子的分子量为50KD,IgG的轻重链在50kd和20kd左右,而且这两条带western要出来的,所以沉淀下来目的蛋白的可能性很小。另外如果沉淀下来目的蛋白的量少,抗体敏感性再差一些,也可能引起阴性。 不知道可不可以做一个rabbit一抗的对照以明确2条带的性质?
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dxy_pni5ki46

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igg组应该是非特异性的吧不应该有这么明显的条带,反而是input像是igg的结果
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于小闹0808

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我认为是抗体有问题,可以直接跑常规WB验证一下,根据你的input你的第三个泳道的条带,应该是非特异性
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jey1235

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如果确保input是有表达目标蛋白的话,有可能是WB抗体特异性不好,有可能是input量太低。 但是看IgG的条带感觉 IP的效果也很不理想,建议换一个tag或者换一下一抗试试。 个人感觉先确定WB的抗体效果,或者换内源/标签抗体,先确认表达问题。
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dxy_4uyyu09r

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这两个蛋白都是表达量很低的吗?有没有预测或者qpcr的结果来参考,如果不是的话建议加大上样量,或者优化抗体使用浓度input这种就是没有处理的正常组不会完全没有条带的。
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bamboopiggy

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你裂解total input的裂解液是不是和煮ip beads的不一样?理论上igG应该拉不下条带来,input的位置应该有条带,感觉是你ip的抗体不特异。先换抗体试试。
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飞天幻雪

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input条带这么少,是不是蛋白表达本身就很低?只有ip后才能出现目的条带。还有一种情况就是ip后的是非特异的条带!建议下次多做几个阳性对照,同时也可以提高上样量看看蛋白到底是不是真的本底水平就很低
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zxb597

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没检测到与目的蛋白相互作用的蛋白或者检测得到的信号太弱,或者不稳定。
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dxy_w4oj7yoe

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是不是input浓度太低了?显然beads能把蛋白拉下来,说明蛋白肯定在,亲和也没问题,可以试一下先把input上个梯度做个wb看一下,再确定实验组的上样量
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