师弟问了我 25 个引物相关的问题

1.      引物是如何合成的？

目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。 DNA 合成仪有很多种 , 主要都是由 ABI/PE 公司生产，而 Bioneer自行研制 的专利 384并行高通量 DNA合成仪， 可实现 99% 的高合成率。无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。

亚磷酰胺三酯法合成 DNA 片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将 DNA 固定在固相载体上完成 DNA 链的合成的，合成的方向是由待合成引物的 3′ 端向 5′ 端合成的，相邻的核苷酸通过 3′→5′ 磷酸二酯键连接。

第一步是将预先连接在固相载体 CPG 上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其 5′- 羟基的保护基团 DMT ，获得游离的 5′- 羟基。

第二步，合成 DNA 的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的 3′ 端被活化， 5′- 羟基仍然被 DMT 保护，与溶液中游离的 5′- 羟基发生缩合反应。

第三步，带帽 (capping) 反应，缩合反应中可能有极少数 5′- 羟基没有参加反应 ( 少于 2%) ，用乙酸酐和 1- 甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。

第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。

经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的 5′- 羟基上的保护基团 DMT ，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察 TCA 处理阶段的颜色判定合成效率。

通过氨水高温处理，连接在 CPG 上的引物被切下来，通过 OPC, PAGE 等手段纯化引物，成品引物用 C18 浓缩、脱盐，沉淀。沉淀后的引物用水悬浮，测定 OD260 定量，根据定单要求分装。

2. 引物纯化方式有哪些，如何选择？

◆　脱盐

寡核苷酸合成后，为了纯化寡核苷酸成为天然的 DNA 结构，首先必须去除保护基团。通过浓氨水处理，合成的寡核苷酸从固相载体上分离， 2- 氰乙氧基--磷酸二脂键的保护基团，以及碱基的保护基团基（苯甲酰基和异丁基）被去除，从而形成了天然的 DNA 结构。然而，必要的去保护步骤完成后，寡核苷酸混合物还包含几种必须被去除的小分子有机化合物。所有非必须有机化合物被移除的过程通常叫做脱盐。脱盐纯化可以借助反向硅胶柱进行。尽管脱盐纯化可以移除所有的非必须有机杂质，但它不能有效移除合成中产生微量的提前终止的寡核苷酸杂链。然而，脱盐的寡核苷酸还是能够满足ＰＣＲ检测等基础生物研究。

◆　 BioRP / OPC 纯化

如果寡核苷酸以 “ 三苯甲基 ” 的形式合成，则 N- 甲基寡核苷酸包含5’-DMT 基团，提前终止的寡核苷酸不包含该基团。因为 DMT 基有强的亲脂的特性，有5’-DMT 基团的寡核苷酸与反相树脂有亲和性，因此反相亲和树脂通常被用于寡核苷酸的纯化。利用反向树脂和5’－ DMT 寡核苷酸存在强亲和力，但是提前终止的寡核苷酸不包含 DMT 基团，所以，我们能够成功的把想要的 N- 甲基寡核苷酸从提前终止的寡核苷酸杂质中分离出来。

◆　 HPLC

如果合成的寡核苷酸应用于克隆，定向诱变或定量的基因探测，那么对其纯度要求较高。脱盐或 OPC 纯化的寡核苷酸可能达不到要求，则 HPLC 纯化被广泛地用于这个目的。作为一种纯化树脂，阴离子交换树脂或反向树脂被用于寡核苷酸纯化。阴离子交换树脂的 HPLC 通常显示 95-98% 纯化效率，对于达到 35-mer 寡核苷酸的纯化是充分的。反向树脂化的 HPLC 与阴离子交换树脂的 HPLC 呈现相似的纯化效率。因为 HPLC 的纯化效率很大程度依靠寡核苷酸的长度，用 HPLC 法不能有效纯化长的寡核苷酸（大于 35-mer) 。

◆　 PAGE

对于长的寡核苷酸的纯化（ 50-100mer ），我们推荐 PAGE 纯化法，它使用交连的聚丙烯酰胺凝胶 ( 电泳 ) 作为纯化基质。尽管 PAGE 显示出高的纯化效率（＞ 98% ），但它在额外的步骤方面有一些缺陷，比如在 PAGE 之后需要提取和脱盐，继而将导致纯化产率的下降。

3. 引物的 OD 数如何定量？

答：引物合成引物 OD 数是这样测定的：用紫外分光光度计，波长 260nm ，石英比色杯，光程为1 厘米，测定溶液的光密度。测定时溶液的光密度最好稀释到 0.2-1.0 之间。 DNA 干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，用 1ml 水稀释测 OD 值。需要根据稀释倍数换算出母液的 OD 值。

4. 需要什么级别的引物？

答：引物常用的纯化方式脱盐、 BioRP / OPC 纯化、 PAGE 纯化、 HPLC 纯化。根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。

5. 最长可以合成多长的引物？

答：引物越长，出现问题的概率就越大。有的公司合成过 120base 的引物，产率很低。除非需要，建议合成片段长度不要超过 80mer ，按照目前的引物合成效率， 80mer 的粗产品，全长（还不一定正确）引物的百分比不会超过 40% ，后续处理还有丢失很多，最后的产量很低。

6. 需要合成多少 OD 数？

答：根据实验目的确定。一般 PCR 扩增， 2 OD 引物，可以做 200-500 次 50ul 标准 PCR 反应。如果是做基因拼接或退火后做连接， 1 OD 就足够了。但是有些研究人员，就做几次 PCR ，但是却要 5-10 OD 。做全基因构建的引物都比较长，但是我们有些研究人员也要求高 OD 数。片段越长 , 最后全长得率就越低，出错的几率就越大。超出需要之外的 OD 数要求，其实也是对社会资源的一种浪费，同时也从一个侧面反映了部分研究人员特别是新手的自信心不足，总觉得需要重复多次才能成功。

7. 如何检测引物的纯度？

答：实验室方便的作法是用 PAGE 方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取0.2-0.5OD 的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性 (95℃,2mins)。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。 600V 电压进行电泳，一定时间后 ( 约 2-3 小时 ) ，剥胶，用荧光 TLC 板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。如果条件许可，也可以用 EB 染色或银染方式染色。

而有的厂家提供 Maldi-TOF质谱 QC质量控制，从而保障了合成的准确率 ：

Bioneer 使用多重 Maldi-TOF 质谱仪进行全自动装载及监测。 每份样品的质谱分析数据将自动插入到寡核苷酸的信息单中。 Bioneer 是世界上仅有的几个对生产的每份核苷酸 ( 单个寡核苷酸和高通量和成 ) 都用 MALDI-TOF 质谱仪检测进行核苷酸 QC 检测的厂商，而且免费提供质谱数据。

8. 如何计算引物的浓度？

答：引物保存在高浓度的状况下比较稳定。引物一般配制成 10-50pmol/ul 。 一般情况下，建议将引物的浓度配制成 50pmol/ul ，加水的体积（微升）按下列方式计算： V ( 微升 )= OD 数 ~1（乘） 33 * （乘） ~1（乘） 20000 / ( 除 ) 引物的分子量。引物的分子量可以从合成报告单上获得。如果需要配制成其他浓度，按上述公式换算。

注意： 1 OD260= 33 ug/ml.

9. 如何计算引物的 Tm 值？

答：引物设计软件都可以给出 Tm ，与引物长度、碱基组成、引物使用缓冲的离子强度有关。

长度为 25mer 以下的引物， Tm 计算公式为：

Tm =            4℃   (G + C)+            2℃   (A + T)

对于更长的寡聚核苷酸， Tm 计算公式为：

Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) - 600/size

公式中， Size = 引物长度。

Tm 的定义： Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrations favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cations stabilize the DNA duplexes.

10. 引物（含修饰）的分子量是如何确定的 ？

答：非修饰的引物的 Molecular Weight 在随引物提供的报告单上都有明确的标示。如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为 324.5 ，引物的分子量 = 碱基数 x 碱基的平均分子量。或按下列公式计算 MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod) ＋（ Nx * Wx ） +( Nundefined Wi) +1undefined Ns- 62.

NA, NG, NC, NT, Ni 分别为引物中碱基 A 或 G 或 C 或 T 或 I 的数量， WA, WC, WG, W, Wi 分别为引物中碱基 A 或 G 或 C 或 T 或 I 的分子量， Nmod ， Wmod 分别为修饰基团的数目和分子量。

对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数，例如 G+A 混合的分子量为（ 313.21+329.21 ） /2 = 321.21 。 Ns 为硫代数目，硫代每个位置增加分子量 16 。

常规碱基分子量：

常规修饰基团分子量

11. 如何溶解引物？

答：干燥后的引物质地非常疏松，开盖前最好离心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，将引物粉末收集到管底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或            10mM Tris pH7.5 缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的 pH 值比较低（ pH4-5 ） , 引物在这种条件下不稳定。

12. 如何保存引物？

答：引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成片状物质。引物在溶解前，室温状态下可以长期保存。溶解后的引物 -20 度可以长期保存。如果对实验的重复性要求较高，合成的 OD 数较大，建议分装，避免反复冻融。修饰荧光引物需要避光保存。

13. 合成的引物5'端是否有磷酸化

答：合成的引物            5'    为羟基，没有磷酸基团。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行 5′ 端磷酸化，或者要求引物合成公司合成时直接在 5′ 或 3′ 端进行磷酸化，需要另外收费。

14. 引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题？

连接反应需要引物的            5’磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上，引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上，需要检查载体的酶切效果，需要改善引物退火的条件。 SiRNA 分子具有特殊的对称结构，退火的难度较大，退火时需要提高退火温度。

15. 测序发现引物有突变是怎么回事？

答：测序发现引物区域有突变，特别是 40 个碱基以下的引物 , 发生的概率不大，但是肯定也会发生。用户一般可以放心，引物序列一般都是通过电脑直接将您的序列 COPY 到合成仪的，碱基输错的机会不多。核酸合成公司一般会有一套控制办法，预防碱基输入错误。发生这种突变的原因有很多解释，人们还没有办法彻底解决这个问题。引物合成的固相合成原理都一样，采用的机器也基本相同，合成主要原料都是由可数的几家跨国公司提供的，所有每个合成服务商遇到的问题也基本类似，没有人可以超脱。

引物合成是一种多步骤的化学反应，合成效率最高也就是 99% ，副产品不可以避免。引物序列中插入突变往往是碱基重复，一般认为，偶连过程中，正在偶连的部分单体发生丢失 DMT, 导致单体又接了上去，故发生插入同一碱基的突变。至于缺失突变，一般认为是一般认为是带帽 (capping) 反应不彻底造成的， Caping 反应主要是封闭极少数 5′- 羟基没有参加反应单体。被封闭的引物，在下一轮偶连时将不能继续参与合成。对于碱基置换的突变，产生的原因一般认为是碱基不能 100% 脱保护，即引物上可能含有残留保护基团，引物的这些区域不能很好地与互补链配对，当扩增的产品被亚克隆转化到大肠杆菌中，可能被细菌中修复系统补上了非配对的碱基。置换突变通常发生在 G 转换成其它碱基。碱基 G 在一定条件下可以转化为烯醇异构体 （脱嘌呤）， 2,6 diaminopurine , DNA 复制和扩增过程中 DNA 聚合酶将 2,6 diaminopurine 看作碱基 A ，测序就会发现碱基 G-A 置换。脱嘌呤现象在富含嘌呤的引物中发生的频率较高。脱嘌呤的引物在引物后处理脱保护阶段如果被降解，测序就会发现碱基 G 或 A 的缺失。

引物合成过程中，造成碱基插入，缺失，置换突变的因素客观存在，有不少降低发生的频率建议和措施，但是这些措施还停留在实验室阶段，还没有能够应用到规模化生产中。

16. 长链引物为什么出错的几率非常高？

答：引物合成时，每一步反应效率都不能达到 100% ，产生碱基插入、缺失、置换突变的因素客观条件都有一直存在。引物链越长，突变的频率累加起来就越高。研究人员总希望合成的引物万无一失，这种心情可以理解。但是犹如 PCR 扩增，不可能绝对保证扩增产物中没有突变，引物合成也不可能保证 100% 正确。要知道，引物合成中发生错误（非人为因素）的频率，比任何高保真高温聚合酶 PCR 扩增过程所产生的频率都要高。做引物合成，长链引物合成，您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。

17. 如果测序发现突变，该如何处理？

答：遇到这种情况，首先和核酸合成厂家取得联系，生产人员会检查生产的原始记录，主要是核对合成序列是否和定单一致，他们在电脑中一般会保留所有原始数据。在确认引物合成序列没有输错的情况下，建议重新挑取克隆测序，可能会找到正确克隆的。根据经验， 40 个碱基以下的引物，测 1-2 个克隆就可以了； 40 个以上的特别是用于全片段拼接合成的，就需要多测一些了。一般情况下，每个克隆突变的位点都不一样，提示正确的总是有的，就是如何找到它。也可以要求公司将引物免费重合一次，不过重合的引物和第一次的引物一样，都可能含突变，不会因为重合的引物就减少您的遇到问题的几率。基因拼接过程中，如果发现一段区域突变点不多，就多测几个，否则就重合一下引物。

18. 引物是经过 PAGE 纯化的，为什么还有碱基缺失或插入？

答：理论上分析型 PAGE 变性电泳，可以区分引物之间一个碱基的差别。但是制备 PAGE 电泳，上样量都是非常大，电泳时的条带非常宽，带与带之间有重叠，分辨率已下降，电泳后割带回收目的引物时，很难说不割到差别仅几个碱基的引物。国内有一个不好的现象， PAGE 纯化的引物，特别是长引物要的量都比较高，导致割的条带有时可能比较宽。建议：您如果减少 OD 数，引物遇到的问题可能就会少一些。

19. TaqMan 探针设计的基本原则是什么？

答：下列原则供您参考。
◆ TaqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物 50-150bp ），但不能与引物重叠。
◆ 长度一般为 18-40mer 。
◆ G-C 含量控制在 40-80% 左右。
◆ 避免连续相同碱基的出现，特别是要避免 GGGG 或更多 G 出现。
◆ 在引物的5'端避免使用 G 。
◆ 选用比较多的碱基 C 。
◆ 退火温度 Tm 控制在 68-            70C   左右。

有用的荧光染料参数

20.Primer 设计的基本原则是什么？

答：引物设计的下列原则供您参考。
◆ 引物长度一般在 18-35mer 。
◆ G-C 含量控制在 40-60% 左右。
◆ 避免近          3'    端有酶切位点或发夹结构。
◆ 如果可能避免在          3'   端最后 5 个碱基有 2 个以上的 G 或 C 。
◆ 如果可能避免在            3'    端最后 1 个碱基为 A 。
◆ 避免连续相同碱基的出现，特别是要避免 GGGG 或更多 G 出现。
◆ 退火温度 Tm 控制在 58-            60C    左右。
◆ 如果是设计点突变引物，突变点应尽可能在引物的中间。

21. 为什么引物的 OD260/OD280 小于 1.5 ？

答：引物应该全是 DNA ，但是 OD260/OD280 的比值为什么那么低，怎么会有蛋白质污染？引物化学合成，哪里有机会污染到蛋白质？需要指出的是OD260/OD280 的比值不能用来衡量引物的纯度。 OD260/OD280 的比值过低一般是由于引物中 C/T 的含量比较高所致。下表是一个 20mer 同聚体引物的 OD260/OD280 的比值，清楚表明 OD260/OD280 的比值与引物的碱基组成密切相关。

A260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base Compositions

22. 同样的 OD 用 PAGE 检测， EB 染色为什么深浅不一？

答：通常可以用 EB 染色的方法来判断双链 DNA 的量 ( 如质粒 DNA) ，因为 EB 可以嵌合到双链 DNA 中。而合成的单链 DNA ，由于碱基组成不同，形成二级结构的可能性不同， EB 的染色程度也会有差异，比如 Oligo(dT) 等不形成二级结构， EB 染色效果就非常差。所以不要用 EB 染色的方法来定量，而用紫外分光光度计检测。同样道理，用 EB 染色来照片不适合所有引物。

23. 引物不纯会有什么后果？

答：引物不纯可能会导致： 1) 非特异性扩增； 2) 无法用预先设计在引物 5′ 端酶切位点的酶切开，特别是没有保护碱基的引物； 3) 用于测序出现双峰或乱峰。解决办法重新合成或重新纯化。

24. 已经溶解的引物，为什么原先使用正常，而过一段时间再使用就不好 了？

答：如果溶解引物的水 PH 过低或污染了菌或核酸酶，会使引物降解。使用时没有充分解冻混合，液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物，避免反复冻溶。建议使用10mMT ris pH7.5 缓冲液溶解引物，因为有些蒸馏水的 pH 值比较低（ pH4-5 ） , 引物在这种条件下不稳定。还有一种可能性是引物没有问题，而是 PCR 使用材料特别是模板的质量与先前使用的不完全一致。

25.PCR 扩增不出就引物有问题吗？

答：基本不是。当今发展出各色各样的 PCR 扩增技术，各色各样的高温聚合酶，就是来解决 PCR 扩增中遇到的扩不出、扩增效率低的问题。如巢式 PCR 就是扩增那些拷贝数很低的基因片段。 有些重复片段的扩增 , GC 含量高的片段，非要采用特殊扩增手段才能扩增出了。

引物扩增不出，主要是下列两种情况比较常见：

（ 1 ） RT-PCR 。请注意，很多基因通过常规 RT -PCR 方法是很难扩增出来的。 RT- PCR 成功的关键在于 RT 的反应的 RNA 质量和目标基因在特定组织和细胞中含量。

（ 2 ）从基因组中扩增。一般情况下，基因在基因组中都是单拷贝，基因组作为模板需要严格控制用量。基因组 DNA 过高，会影响反应体系中的 Mg 和 pH