蛋白表达自动诱导系统以及大幅度提高产量

包含体的形成与否与普通IPTG诱导的结果相当，我经验看来，可溶性的效果上可能还好些，因为乳糖的诱导不同于IPTG，它要经过好几个过程，同时它又是碳源之一，所以它的诱导是很温和的一个过程，而IPTG是很剧烈的一个过程，浓度高的时候，蛋白的折叠速度就会跟不上表达速度，导致包含体的形成。我在IPTG诱导时的两个可溶性蛋白，在5052系统中也是完全可溶的。我一直用的Rosetta(DE3)plys，你应该知道吧，带有稀有密码子的。这种plysS菌确实有点慢，我在MDG里摇的很慢，可能就跟菌有关系。

有人向我询问具体的实验步骤，这个要写出来很长，不过我这有国外一个实验室使用的protocol，里面有很详细的实验步骤。看这个protocol的时候要注意，这个protocol是studier给他的一个早期版本，在培养基的采用上与现在studier的实验室使用的有所区别，但结果没什么区别，大家可以随意采纳，我现在用的studier实验室普遍采用的配方，即用的是MDAG（protocol里是用zyp-0.8G)，做小摇菌种和保存菌种用（注意studier用的MDG，但我发现这个很难摇起来，可能跟供氧有关），用ZYM-5052（protocol里是用ZYP-5052)表达蛋白用，对于一般的质粒用LB＋1％glucose的平板划线，对于毒性质粒用MDAG做的平板转化，. 还有protocol里是晚上1：1000接到大瓶里摇，早上收菌就可以提蛋白。我的一般是摇20个小时左右，因为我没用baffled flask，菌长得慢些，你一定要保证里面的葡萄糖被消耗光，蛋白才会表达。通常第一次做的时候，可以摇长些，不同时间段测OD值，取样看看蛋白表达情况，以后就心中有数了。

但是当质粒在菌体中安全无害的时候，没有抗生素，质粒也能维持一定的拷贝数。我还有个有毒蛋白的问题，也因此彻底解决了。感觉太好了，这套系统我相信在不久将来会全面普及，事实上我刚开始研究这套系统时，网上还没什么资源，但是仅仅过了一个多月，就发现已经有很多结构研究的实验室采用这套系统了。这套系统尤其适用于高通量筛选。因为做高通量的人可能知道，构建好了一批质粒后，想同时做表达测试老出问题，就是含有不同质粒的菌很少同步地摇起来。用studier的系统能有效解决这个问题。我相信中国搞结构的实验室很快会普及这个方法。这里我把我用的一些资源整理给大家，有问题可以共同讨论一下，里面有我在组里的一个报告，是在studier的ppt基础上修改的，还有studier的原始论文，和他给出的详细配方

最近2个月一直在研究studier的auto-induction Protein Expression System. 他今天三月份在Protein expression and purification上发表了一篇长达28页的文章“Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures。 Protein Expression and Purification 41 (2005) 207–234” 综述了3年来冷泉港一直在用的他发明的方法。看了之后感觉studier这个人太牛了，pet系统就是他发明的。但为了解决表达型质粒的自发诱导的问题（就是不加诱导剂，菌液摇到饱和时总有目的蛋白自动表达的问题，这也是有毒蛋白不能表达的原因），他彻底研究了培养基的每一种组分，最后发现是胰蛋白胨里的少量的乳糖在作怪，他同时又发现了葡萄糖，和氨基酸能抑止乳糖的诱导，在培养基的研究中，他发明了全新的培养基组分，在这种培养基里，菌液的OD值很简单的就能达到5－50左右，在此基础上，他发明了自动诱导系统，就是在培养基里含有少量葡萄糖（0.02%),和0.2%的乳糖，当然还有其他营养组分。当菌液摇到饱和时，这时葡萄糖已经被消耗光，就开始利用乳糖，而乳糖的中间代谢产物异乳糖就相当于IPTG，就自发的开始了诱导，由于菌液相当的浓，蛋白产量普遍能提高几倍到几十倍，我用这套将我的一个蛋白从10毫克每升产量一下子提高到了150毫克每升。我的菌液一般饱和在OD值8左右，这比studier说得要低一些，因为我没用他说的baffled flask来培养，这种培养瓶就是底部像可乐瓶底那样，供氧量能极大提高。 他的配方还彻底解决了有毒蛋白，质粒不稳定等一系列问题。以前的质粒不稳定和蛋白有毒导致无法划线，主要是因为即使在没有诱导剂的情况下，菌仍然会表达少量的外源蛋白，一旦质粒表达外源蛋白，菌就倾向于排斥这个质粒，如果蛋白有毒，菌甚至会无法生长。但是新的培养基中，质粒不会表达外源蛋白，质粒在表达菌中就跟在克隆菌中一样，大家共同繁荣，相当稳定。菌液（即使带有超毒性的质粒）可以4度冰箱存放好几个星期。还有人提出表达的时候甚至不用加抗生素，因为抗生素一个作用是抑止杂菌，但是其更大的作用在于能维持质粒的拷贝数，菌需要质粒才能活啊。