请问磷酸化不是发生在蛋白修饰阶段吗为什么在文章里看到了磷酸化的引物来进行处在mRNA水平的PCR实验

我感觉是这篇文章出现的一个错误：1：压根没有pSTAT3这个基因，是怎么设计的引物，我们在文章中常见的检测pSTAT3方法大都是WB，没见过qPCR；2：磷酸化是翻译后的修饰，只发生在蛋白水平，转录水平怎么会出现磷酸化。

你可能需要仔细看一下文献，这篇文章这么设计的目的是什么:是不是需要比较非磷酸化和磷酸化stat3对另一个分子的影响的不同呢?

以此来说明stat3行使文献中的功能和他的磷酸化状态有关呢?

质粒和PCR产物需要拿去测序有2个目的，一是验证插入序列的DNA序列是否无误。第二是看插入的方向和位置是否正确。如果做定量PCR用到质粒的话，一般是用来做标准曲线的。

聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。由1983年美国Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。到如今2013年，PCR已发展到第三代技术。1973 年，台籍科学家钱嘉韵，发现了稳定的Taq DNA聚合酶，为PCR技术发展也做出了基础性贡献。

PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。

mRNA水平也可以进行磷酸化修饰，体外实验常在这个水平做，你指的是体内的自然过程

磷酸化是一种常见的蛋白质修饰方式，通常发生在氨基酸残基上。但是，在某些情况下，磷酸化也可以作为一种信号传递机制，参与到基因表达调控的过程中。

在转录调控中，磷酸化通常与转录因子相互作用，以调节基因表达。因此，在进行mRNA水平的PCR实验时，我们可以使用针对磷酸化特定位点的引物，来检测磷酸化状态对转录因子的调节作用。这种方法被称为ChIP-PCR（染色质免疫共沉淀PCR）。

在这种方法中，磷酸化的转录因子会被特异性抗体识别并沉淀下来，与DNA结合的区域也会随之一同沉淀。然后，通过PCR来检测特定的DNA序列是否被沉淀下来，从而确定磷酸化状态对基因表达的影响。

因此，磷酸化不仅仅是一种蛋白质修饰方式，也可以作为转录调控机制的一部分，参与到基因表达的调控中。