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用PMD-18T载和我的目的片段174bp连接后画板做了筛选,挑单菌落在有抗性的LB扩菌后,进行了菌液PCR有目的条带而且没有杂带,但提取质粒后跑PCR有目的条带但也有杂带。重组质粒是想用来做荧光定量PCR的标准质粒的,是引物特异性不高
毛利小五郎的徒弟
更换引物,这个结果说明引物差异性太大
loveliufudan
在提取质粒后跑PCR时出现杂带,通常有几个可能的原因:
污染:可能在提取质粒的过程中,有外源性的DNA或RNA污染了样品,导致PCR时出现了杂带。你可以尝试更换提取质粒的试剂盒,或者增加样品处理过程中的洗涤步骤,以减少污染的可能性。
引物非特异性:可能PCR的引物不够特异,会引起非特异性扩增。你可以尝试优化引物的浓度和反应条件,或者设计新的引物来提高特异性。
质粒不完整:可能质粒的完整性不够好,导致PCR时扩增了不完整的质粒或质粒断片。你可以尝试使用其他方法来检测质粒的完整性,如酶切、测序等。
总之,建议你重新检查样品处理过程中的操作流程,优化PCR反应条件,重新设计引物,以及尝试其他方法来检测质粒完整性,以提高PCR反应的特异性和准确性。
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