引物设计一定从启动子开始吗？

这题我会！不一定要从起启动子开始，可以从网站上查找目的基因mRNA的序列，之后从启动子两端的序列设计引物，这样可以选择很多引物配对，但是最后扩出来的序列一定要包含你的CDS区

看你的实验目的，是要扩全长，还是要做realtime pcr

这个不一定，但是大部分人的习惯就是这样。这个问题很简单，扩增序列应该称为目的基因，目的基因一般都上万bp，从两头开始当然不合适。PCR扩增只能扩增出上下游引物之间的序列，因为只有引物之间的DNA双链是解链状态的。看引物设计的位置在哪里了，一般来说扩增的片段都是两条引物中间的那段模板。你用扩增的引物测序的话，最好是双向测序。或者，重新合成引物进行测序会比较好，测序引物的纯化要求较高,而且引物片段不能大于20多个bp。

设计引物不需要加启动子，载体上都有。

是的，PCR时，引物设计建议从启动子开始设计引物。