如何确定普通反转录 PCR 时 cDNA 的用量？

想喝豆浆

2013-10-06

做普通的反转录 PCR，我的理解是算目的和内参的比值来比较。但是内参和目的是不同的孔来扩增的，如果扩增程序是一样的，是否说明扩增的倍数是一样的，于是乎是有可比性的？用不用保证cDNA的量是一样的？怎么保证？文献上的内参都是齐刷刷的……那么模板量是不是一样的？……

4 个回答

想喝豆浆

2013-10-09

有帮助

多谢以上各位！明白了！但是有个内质网应激方面的指标XBP1，文献都是用跑电泳来看splicing形式的多少，就是说扩出来是两种产物，貌似没查到用RT-qPCR的…………

苏格兰白草莓

2013-10-08

有帮助

必须要保证cDNA的量要一致才有可比性，所以最好还是做RT-qPCR。之所以要做内参，一是利用△△C法运算得到基因差异，二就是利用内参可看得出你每孔的cDNA模板量是否具有一致性，一般来说，我们实验要求样品内参的Ct值最好相差不要超过0.2~0.5，还有值得注意的是，如果内参Ct值出现过大或者过小都会影响到你的实验数据分析，一般来说内参在Ct值=12~15的位置左右为宜

王建勇

2013-10-08

有帮助

要保证cDNA的量是一定的。因为内参在不同组表达恒定，所以cDNA恒定，内参就恒定。在这个前提下再去比较目的mRNA。

alaling

2013-10-08

有帮助

既然你需要进行这方面的比较，为什么不采用real-time PCR？RT-PCR只能用来定性检测，即大概看看是否多了或者少了，不能进行半定量，更不能进行定量。
另外，如果你非得采用这种方法，模板量是一定要一样的