急急急，做了快两个月了，质粒和连接产物转化平板无菌落

我的是无缝克隆连接的pET-28a 重组载体，转化了DH5a和BL21（DE3）感受态多次，老是不长菌，后来同时拿质粒做DH5a和BL21（DE3），也不长菌，试了好多不同抗性的质粒，也是不长菌，但之前这些质粒转化都成功了。一开始怀疑感受态问题，买了新的感受态也不长菌，而且其他同学用着没有问题。怀疑是LB固体平板和抗生素的问题，用了其他同学的平板也不长。而且将复苏培养后的感受态同时在抗生素平板和无抗平板上，两种平板都没菌体生长。

 

让其他同学帮我做，一开始DH5a长了，菌落PCR也有阳性，但是备份平板一转接到LB液体培养基中就又不长了。

 

转化步骤：从-80度冰箱里拿出感受态放在冰上5分钟融化，然后加入我的连接产物9ul、质粒2ul，3ul，6ul都试过（质粒浓度大概60ng/ul吧），冰浴30min，42度热激90s（前几次是60s，后来改成90s），然后冰上放2min，加入900ulLB，220转1h，之后离心弃上清800ul，剩下混匀细胞涂200ul，最后倒置培养14h，结果就是不长菌。我为这个问题都耽搁了两个月了，期间用过自己倒的平板和其他人倒的平板，就是不长菌,平板中卡那浓度是50ug/ml，氨苄的浓度是100ug/ml

 

主要是之前能转化成功的质粒现在都转不进去了，基本把能排除的东西都排除了，找不到原因，请大家帮忙看看还有没有其他问题。