细菌的转化与平板筛选

实验原理

感受态是指 细菌 处于容易吸收外源 DNA 的状态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导人细菌的过程。其原理是细菌处于0℃，CaCl 2 低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。

转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基―钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Ampr等)得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上。

重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选鉴定。利用α互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法。现在使用的许多载体都具有一段 大肠杆菌 β半乳糖苷酶的 启动子 及其编码α肽链的DNA序列，此结构称为lacZ'基因。

lacZ'基因编码的α肽链是β半乳糖苷酶的氨基端的短片段(146个 氨基酸 )。任何携带着lacZ'基因的质粒载体转化了染色体 基因组 存在着此种β半乳糖苷酶 突变的大肠杆菌细胞后，便会产生出有功能活性的半乳糖苷酶，在IPTG(异丙基β-D-硫代半乳糖苷)诱导后。

在含有Xgal(5-溴-4-氯-3-吲哚-6-D-半乳糖苷)的培养基平板上形成蓝色菌落（半乳糖苷酶能将无色的化合物Xgal切割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-靛蓝）。

而当有外源DNA片段插入到位于lacZ'中的多克隆位点后，就会破坏α肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内突变的β半乳糖苷酶相互补的活性α肽，而导致不能形成有功能活性的β半乳糖苷酶，也就不能分解Xgal而显蓝色，因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落。

主要试剂

1. 0.1mol／L CaCl 2 溶液

2. LB液体培养基及LB固体培养基

3. 氨苄青霉素(Amp)：用无菌水配制成100mg／mL溶液，置-20℃冰箱保存。

4. Xgal：将Xgal溶于二甲基甲酰胺，配成20mg／mL，不需过滤灭菌，分装小包装，避光贮存于-20℃。

5. IPTG：取2g IPTG溶于8mL双蒸水中，再用双蒸水补至10mL，用0.22um滤膜过滤除菌，每份1mL，贮存于-20℃。

主要设备

1. 超净工作台

2. 低温离心机

3. 恒温摇床

4. 恒温箱

5. 恒温水浴

6. 离心管

7. 试管

8. 培养皿

9. 锥形瓶

10. 接种针

11. 玻璃涂棒

12. 酒精灯

13. 镊子及牙签

实验材料

1. 大肠杆菌DH5α

2. 质粒

实验步骤

1. 制备感受态细胞

1) 吸取15µl E.coil菌液，接种于20ml LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，待OD 600 =0.5左右将该菌悬液以1：50接种量转于50ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20-30min测一次OD 600 ，至OD 600 =0.6左右，停止培养。

2) 培养液转入离心管中，在冰浴10min，4℃下5000rpm离心10min。

3) 弃上清液，用4ml冰预冷的0.1M CaCl 2 溶液轻轻悬浮菌体至均匀，冰上放置30min

4) 4℃下5000rpm离心6min。

5) 弃上清液，用2ml冰预冷的0.1M CaCl 2 溶液轻轻悬浮菌体至均匀，冰上放置片刻后即制成感受态细胞悬液。

6) 以上制好的感受态细胞悬液可在冰上放置，24小时内直接用于转化实验，也可加入15%高压灭菌过的甘油，混匀后，分装于1.5ml离心管中，每管100µ l感受态细胞悬液，置-70℃条件下保存。.

2. 质粒DNA转化大肠杆菌

1) 取100µl摇匀后的感受态细胞悬浮液（如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作），加入5µl连接产物，轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42 IPTG水浴中保温90s，然后迅速在冰上冷却2min。

2) 加入900µl LB液体培养基，则总体积约1ml，混匀于37℃振荡培养90分钟使受体菌恢复正常生长状态并使转化体产生抗药性Ampr。

3) 在预制的LB琼脂平板上，加40uL 20mg／mL的Xgal和4uL 200mg／mL的IPTG溶液，并用灭菌玻璃推子(酒精灯上烧后冷却)，均匀涂布于琼脂凝胶表面，37℃倒置吸收。

4) 将恢复培养的菌体4000rpm离心5min，移去上层900µl LB培养基，用余下的100µl重悬菌体至均匀。

3. α互补现象的检查

将重悬菌体均匀涂布于含X-gal加IPTG加氨苄青霉素的LB平板上，37℃倒置培养12-24h，出现菌落。其中白色菌落从理论上讲为重组克隆。

如果进一步验证，可挑取多个白色菌落分别接种到1ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养6-8h，然后提取质粒酶切验证，或进行菌落PCR扩增鉴定。

注意事项

1. 细菌生长状态和密度：不要用经过多次转接和贮存于-4℃的培养菌，最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细菌生长密度则以刚进入生长对数期为好。

2. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行。