细菌的转化与平板筛选
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实验原理
感受态是指细菌处于容易吸收外源DNA的状态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导人细菌的过程。其原理是细菌处于0℃,CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形。
转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基—钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42℃短时间热击处理,促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间,促使在转化过程中获得的新的表型(如Ampr等)得到表达,然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上。
重组质粒转化宿主细胞后,还需对转化菌落进行筛选鉴定。利用α互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法。现在使用的许多载体都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子及其编码α肽链的DNA序列,此结构称为lacZ'基因。lacZ'基因编码的α肽链是β半乳糖苷酶的氨基端的短片段(146个氨基酸)。
任何携带着lacZ'基因的质粒载体转化了染色体基因组存在着此种β半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后,便会产生出有功能活性的半乳糖苷酶,在IPTG(异丙基β-D-硫代半乳糖苷)诱导后,在含有Xgal(5-溴-4-氯-3-吲哚-6-D-半乳糖苷)的培养基平板上形成蓝色菌落(半乳糖苷酶能将无色的化合物Xgal切割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-靛蓝)。
而当有外源DNA片段插入到位于lacZ'中的多克隆位点后,就会破坏α肽链的阅读框,从而不能合成与受体菌内突变的β半乳糖苷酶相互补的活性α肽,而导致不能形成有功能活性的β半乳糖苷酶,也就不能分解Xgal而显蓝色,因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落。
实验步骤
1. 制备感受态细胞
(1)吸取15 μl E.coil菌液,接种于20 ml LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜,待OD600=0.5左右将该菌悬液以1:50接种量转于50 ml LB液体培养基中,37℃振荡扩大培养,当培养液开始出现混浊后,每隔20~30 min 测一次OD600,至OD600=0.6左右,停止培养。
(2)培养液转入离心管中,在冰浴10 min,4℃下5000 rpm 离心10 min。
(3)弃上清液,用4 ml 冰预冷的0.1 M CaCl2溶液轻轻悬浮菌体至均匀,冰上放置30 min。
(4)4℃下5000 rpm 离心6 min。
(5)弃上清液,用2 ml 冰预冷的0.1 M CaCl2溶液轻轻悬浮菌体至均匀,冰上放置片刻后即制成感受态细胞悬液。
(6)以上制好的感受态细胞悬液可在冰上放置,24小时内直接用于转化实验,也可加入15%高压灭菌过的甘油,混匀后,分装于1.5 ml 离心管中,每管100 μl 感受态细胞悬液,置-70℃条件下保存。.
2. 质粒DNA转化大肠杆菌
(1)取100 μl 摇匀后的感受态细胞悬浮液(如是冷冻保存液,则需化冻后马上进行下面的操作),加入5 μl 连接产物,轻轻摇匀,冰上放置30 min 后,于42℃IPTG水浴中保温90 s,然后迅速在冰上冷却2 min。
(2)加入900 μl LB液体培养基,则总体积约1 ml,混匀于37℃振荡培养90分钟使受体菌恢复正常生长状态并使转化体产生抗药性Ampr。
(3)在预制的LB琼脂平板上,加40 uL 20 mg/mL 的Xgal和4 uL 200 mg/mL 的IPTG溶液,并用灭菌玻璃推子(酒精灯上烧后冷却),均匀涂布于琼脂凝胶表面,37℃倒置吸收。
(4)将恢复培养的菌体4000 rpm离心5 min,移去上层900 μl LB培养基,用余下的100 μl重悬菌体至均匀。
3. α互补现象的检查
将重悬菌体均匀涂布于含X-gal加IPTG加氨苄青霉素的LB平板上,37℃倒置培养12~24 h,出现菌落。其中白色菌落从理论上讲为重组克隆。
如果进一步验证,可挑取多个白色菌落分别接种到1ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中,37℃振荡培养6~8 h,然后提取质粒酶切验证,或进行菌落PCR扩增鉴定。
注意事项
1. 细菌生长状态和密度:不要用经过多次转接和贮存于-4℃的培养菌,最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细菌生长密度则以刚进入生长对数期为好。
2. 防止杂菌和杂DNA的污染:整个操作过程均应在无菌条件下进行