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凝集素印迹(lectin blotting)是一种用于检测和分析糖基化蛋白质的方法。以下是凝集素印迹的一般步骤:
1. 样品制备:
a. 提取蛋白质:从感兴趣的细胞或组织中提取总蛋白质。可以使用适当的细胞裂解缓冲液或蛋白质提取试剂盒来提取蛋白质。
b. 蛋白质浓度测定:使用合适的方法(如BCA或 Bradford 法)测定蛋白质的浓度。
2. SDS-PAGE电泳:
a. 准备SDS-PAGE凝胶:根据所需的分离范围和样品量,制备合适的SDS-PAGE凝胶。
b. 加载样品:将提取的蛋白质样品与适当的电泳样品缓冲液混合,并进行热变性处理(如加热至95°C,5分钟)。
c. 电泳:将样品加载到SDS-PAGE凝胶上,并进行电泳分离。根据需求,可以选择不同的电泳条件和电泳系统。
3. 蛋白转印:
a. 准备蛋白转印膜:将合适的蛋白转印膜(如PVDF或NC膜)切割为适当的大小,并进行湿式或半干式电泳转印。
b. 蛋白转印:将分离的蛋白质从SDS-PAGE凝胶转移到蛋白转印膜上,根据所选的电泳转印条件进行转印。
4. 阻断和洗涤:
a. 阻断:将转印膜置于适当的阻断缓冲液中,在室温或4°C下进行阻断,以防止非特异性结合。
b. 洗涤:使用适当的洗涤缓冲液洗涤转印膜,以去除非特异性结合的蛋白质。
5. 凝集素结合:
a. 准备凝集素溶液:根据实验设计选择适当的凝集素,并将其稀释在适当的结合缓冲液中。
b. 孵育转印膜:将转印膜置于凝集素溶液中,在适当的温度和时间下孵育,使凝集素与特定的糖基化蛋白质结合。
6. 洗涤和检测:
a. 洗涤:使用适当的洗涤缓冲液洗涤转印膜,以去除未结合的凝集素。
b. 检测:使用合适的方法进行凝集素结合的蛋白质的检测,如酶标记的二抗和相应的显色底物。
7. 数据分析:
a. 使用图像分析软件(如ImageJ)对凝集素印迹图像进行定量分析,比较不同样品或条件下的蛋白质表达水平。
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1.直接法 标记物直接标记在凝集素上,使之直接与切片中的相应糖蛋白或糖脂相结合。
(1)切片脱蜡至水。
(2)凝集素标记物(100μg/ml),室温,30min。
(3)TBS洗3次,每次2min。
(4)如为荧光素标记物,封片用荧光显微镜观察。如为酶标记物,则应依次进行呈色、脱水、透明和封固后在光学显微下观察。
直接法的优点是简便,目前商品用的凝集素药盒已能购得。但灵敏性不够高。
2.间接法 将凝集素直接与切片中的相应糖基结合,而将标记物结合在抗凝集素抗体上。
(1)脱蜡至水。
(2)用含3%的H2O2的甲醇阻断内源性过氧化物酶10min。
(3)凝集素稀释液(100μg/ml)孵育30min。
(4)TBS洗3次,每次2min。
(5)用标记了的抗凝集素抗体(1:100)孵育30min。
(6)TBS洗3次,每次2min。
(7)呈色、脱水、透明、封片。