凝集素印迹

凝集素印迹（lectin blotting）是一种用于检测和分析糖基化蛋白质的方法。以下是凝集素印迹的一般步骤：

1. 样品制备：

a. 提取蛋白质：从感兴趣的细胞或组织中提取总蛋白质。可以使用适当的细胞裂解缓冲液或蛋白质提取试剂盒来提取蛋白质。

b. 蛋白质浓度测定：使用合适的方法（如BCA或 Bradford 法）测定蛋白质的浓度。

2. SDS-PAGE电泳：

a. 准备SDS-PAGE凝胶：根据所需的分离范围和样品量，制备合适的SDS-PAGE凝胶。

b. 加载样品：将提取的蛋白质样品与适当的电泳样品缓冲液混合，并进行热变性处理（如加热至95°C，5分钟）。

c. 电泳：将样品加载到SDS-PAGE凝胶上，并进行电泳分离。根据需求，可以选择不同的电泳条件和电泳系统。

3. 蛋白转印：

a. 准备蛋白转印膜：将合适的蛋白转印膜（如PVDF或NC膜）切割为适当的大小，并进行湿式或半干式电泳转印。

b. 蛋白转印：将分离的蛋白质从SDS-PAGE凝胶转移到蛋白转印膜上，根据所选的电泳转印条件进行转印。

4. 阻断和洗涤：

a. 阻断：将转印膜置于适当的阻断缓冲液中，在室温或4°C下进行阻断，以防止非特异性结合。

b. 洗涤：使用适当的洗涤缓冲液洗涤转印膜，以去除非特异性结合的蛋白质。

5. 凝集素结合：

a. 准备凝集素溶液：根据实验设计选择适当的凝集素，并将其稀释在适当的结合缓冲液中。

b. 孵育转印膜：将转印膜置于凝集素溶液中，在适当的温度和时间下孵育，使凝集素与特定的糖基化蛋白质结合。

6. 洗涤和检测：

a. 洗涤：使用适当的洗涤缓冲液洗涤转印膜，以去除未结合的凝集素。

b. 检测：使用合适的方法进行凝集素结合的蛋白质的检测，如酶标记的二抗和相应的显色底物。

7. 数据分析：

a. 使用图像分析软件（如ImageJ）对凝集素印迹图像进行定量分析，比较不同样品或条件下的蛋白质表达水平。

1．直接法　 标记物直接标记在凝集素上，使之直接与切片中的相应糖蛋白或糖脂相结合。

（1）切片脱蜡至水。

（2）凝集素标记物（100μg/ml），室温，30min。

（3）TBS洗3次，每次2min。

（4）如为荧光素标记物，封片用荧光显微镜观察。如为酶标记物，则应依次进行呈色、脱水、透明和封固后在光学显微下观察。

直接法的优点是简便，目前商品用的凝集素药盒已能购得。但灵敏性不够高。

2．间接法 　将凝集素直接与切片中的相应糖基结合，而将标记物结合在抗凝集素抗体上。

（1）脱蜡至水。

（2）用含3%的H2O2的甲醇阻断内源性过氧化物酶10min。

（3）凝集素稀释液（100μg/ml）孵育30min。

（4）TBS洗3次，每次2min。

（5）用标记了的抗凝集素抗体（1：100）孵育30min。

（6）TBS洗3次，每次2min。

（7）呈色、脱水、透明、封片。