原理
本方案适合于用100~1 000 bp 长的放射性标记的DNA探针对Southern转印、斑点及狭线印迹进行杂交分析。
材料与仪器
DNA
SDS SSC
水浴锅 培养箱
SDS SSC
水浴锅 培养箱
步骤
1. 用6×SSC润湿带有固定了的DNA的膜。
2. 将膜的DNA面朝上置于杂交管中,ATP溶液的加入量为约1 ml/cm2 膜,在68℃杂交炉中滚动3 h。
3. 在预杂交即将结束时,于100℃将DNA探针变性10 min,置于冰中。
4. 将杂交管中的APH溶液倒掉,换上等体积的预热的APH溶液(68℃),加入变性探针,68℃滚动下杂交过夜。
4. 将杂交管中的APH溶液倒掉,换上等体积的预热的APH溶液(68℃),加入变性探针,68℃滚动下杂交过夜。
5. 倒掉APH液,加入等体积的2×SSC/0.1%SDS,室温下滚动温育10 min。5 min后更换洗膜液。
6. 用等体枳的0.2×SSC/0.1%SDS替换上述洗膜液,室温下滚动温育10 min 后更换洗膜液
7. 如果需要,在42℃,0.2×SSC/0.1%SDS进行15 min 中等严紧度的洗膜2次。
8. 如果需要,在68℃,0.1×SSC/0.1%SDS进行15 min 高等严紧度的洗膜2次。
9. 倒掉最后的洗膜液,在室温下用2×SSC漂洗膜,并吸干多余的液体,用塑料膜包裹后放射自显影。
7. 如果需要,在42℃,0.2×SSC/0.1%SDS进行15 min 中等严紧度的洗膜2次。
8. 如果需要,在68℃,0.1×SSC/0.1%SDS进行15 min 高等严紧度的洗膜2次。
9. 倒掉最后的洗膜液,在室温下用2×SSC漂洗膜,并吸干多余的液体,用塑料膜包裹后放射自显影。
来源:丁香实验