凝集素

 

第三节　凝集素

凝集素（Lectin）是指一种从各种植物，无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，因其能凝集红血球（含血型物质），故名凝集素。其常见种类见表6-1。常用的为植物

表6―1 常见的凝集素一览表

凝 集 素 缩 定 特异性结合 花生（ Peanut agglutinin） PNA D―半乳糖、Gal(1→3)―GalNAC 刀豆（Concanavalin ensifomis agglutinin） ConA D-葡萄糖、D-甘露糖 蓖麻（Ricinus communis agglutinin） RCA D―半乳糖、D-GalNAC>半乳糖 扁豆（Lens cuinaris agglutinin0 LCA D-甘露糖、D―葡萄糖 豌豆（Pisum satiwum agglutinin） PSA D-甘露糖 菜豆（Phaseolus vulgaris agglutinin） PHA D-GalNAC 大豆（soybean agglutinin） SBA D-GalNAC》D-半乳糖 荆豆（Ulex europeaus agglutinin） UEA L-岩 藻 糖 麦胚(Wheat germ agglutinin) WGA D-GalNAC、NANA (Bandeiraea simplicifolia agglutinin) BSA D-半乳糖 双花扁豆（Dolichos bifows agglutinin） DBA D-GalNAC 槐（Sophora japonica agglutinin） SJA D-半乳糖、D-GalNAC

凝集素（Phytoagglutin, PNA），通常以其被提取的植物命名，如刀豆素A（Conconvalina,ConA）、麦胚素（Wheat germ agglutinin, WGA）、花生凝集素（Peanut agglutinin, PNA）和大豆凝集素（Soybean agglutinin, SBA）等，凝集素是它们的总称。凝集素不是来源或参与免疫反应的产物，它们之所以被收入本书，是由于凝集素具有的某些“亲合”特性，能被免疫细胞化学技术方法所应用。因此，Ponder（1983）提出应称“凝集素组织化学”而不能称为“凝集素免疫组织化学”。

一、凝集素的特性

凝集素具有多方面的特性，在此我们仅简要提及其与免疫细胞化学技术方法应用有关的某些特性。我们知道，生物膜中含有一定量的糖类，主要以糖蛋白和糖脂的形式存在。凝集素最大的特点在于它们能识别糖蛋白和糖肽中，特别是细胞膜中复杂的碳水化合物结构，即细胞膜表面的碳脂化合物决定簇。一种凝集素具有对某一种特异性糖基专一性结合的能力，如刀豆素与α―D―吡喃糖基甘露糖（α―D―Mannopyranosy）结合；麦芽素与N―乙酰糖胺（N―acetyl glucosamine）结合；菜豆凝集素与N―乙酰乳糖胺结合（见本章　表6―1）。 因此，凝集素可以作为一种探针来研究细胞膜上特定的糖基。另一方面，凝集素具有多价结合能力，能与荧光素、生物素、酶、胶体金和铁蛋白等示踪物结合，从而在光镜与/或电镜水平显示其结合部位。

二、凝集素的应用

　　一般认为细胞膜上特定的糖基可用以区别细胞的类型和反映细胞在分化、成熟和肿瘤细胞性变中的变化。仅在某些特殊的例子，其细胞结合凝集素的性能可以预先估计，如双花扁豆素之于血型A物质的特异性，荆豆凝集素之于血型O物质2―L―岩 藻 糖的特异性，然而在绝大多数情况下，关于由凝集素所识别的碳水化合物决定簇的种类，关于携带决定簇的分子的性质和机能，完全凭实验经验去发现。

1．作为细胞分化和成熟的标记 　应用凝集素作为细胞分化的标志，在这方面的应用报告最多，而且研究比较集中于血细胞，特别是淋巴细胞的分群。如Rose（1980）等发现在小鼠胸腺皮质内不成熟的T淋巴细胞呈PNA阳性反应，在小鼠小肠集合淋巴小结的生发中心也发现有20%左右的PNA阳性反应细胞，后者是否属于不成熟的T淋巴细胞，是值得进一步研究的问题。Newman等（1979）以荧光素标记凝集素PNA，发现在大鼠乳腺上皮的不同分化时期显示不同的荧光强度。在不成熟的大鼠乳腺上皮细胞，荧光弱或无，随着性成熟期到妊娠期乳腺上皮荧光程度逐渐加强，而泌乳期荧光强度达最高峰。在皮肤角质细胞自基底向表层分化、成熟的过程中，细胞表面的碳水化合物的分布和性质都在改变。Brabed等（1981）应用新生大鼠皮肤的实验表明，皮肤各层细胞分别与不同的凝集素相结合。麦芽素与角质化细胞相结合，蓖麻素与棘细胞和基底细胞相结合，而荆豆凝集素标记在棘细胞的表面。在成肌细胞（myeoblast）的分化与成熟过程中，Winaod 和Luzzati（1975）注意到类似的皮肤的改变。

2．作为细胞特殊类型的标记　Kivela和Farkkanen（1987）发现在人视网膜，PNA标记视锥细胞而不标记视杆细胞。在乳腺、乳腺上皮细胞呈PNA阳性反应而肌上皮细胞和间质细胞呈PNA阴性反应。以多种凝集素对小鼠、大鼠和兔的肾组织切片进行染色结果表明，刀豆素A和蓖麻素存在于肾脏的各部，PNA和双花扁豆凝集素（DBA）主要分布于远曲小管和集合小管上皮细胞，荆豆凝集素（UEA）主要分布在血管内皮细胞，而麦芽素分布在肾小球。应用DBA对RIII和DDK品种的小鼠研究表明，DBA主要结合在各种组织内毛细血管内皮细胞上，电镜观察显示DBA结合在内皮细胞的表面，在趣的是在RIII品系小鼠某些组织的内皮细胞显示肯定的DBA阴性反应，说明同一种属动物的血管内皮细胞也存在有组织特异性的差别。Streit和Kreutzberg（1987）发现Griffonia Simplicifolia凝集素特异性标记面神经节　内的小胶质细胞，其它类型的胶质细胞如星状胶质细胞（astrocyte）等都显示阴性反应。在切断面神经后，增殖的小胶质细胞对Griffonia Simplicifolia凝集素的反应加强，免疫电镜观察表明，凝集素主要沉积在细胞膜或小胶质细胞突起的轴膜表面，特异性结合糖基是α―D―半乳糖。上海医科大学附属肿瘤医院免疫病理室应用12种凝集素（表6-1）对人胚胎及各种正常组织进行了系统的凝集素受体的定位研究，结果表明，凝集素受体的分布并无即定规律可寻。如胃粘膜主细胞为PNA受体，而壁细胞为BSL受体，双花扁豆受体（DBA）主要出现在大肠部份。

　　3．在肿瘤中凝集素结合的改变 　肿瘤细胞伴有细胞膜的改变，细胞膜上的糖基也会产生相应的变化，可用凝集素检测出来。大量研究发现，凝集素可作为肿瘤组织源性的标记、肿瘤特异性诊断的标志、肿瘤恶性的标记和不同肿瘤的分化标记。如张华忠等（1987）报道115例胃癌标记PHA阳性率高达90.43%，而正常胃粘膜基本是阴性，故认为PHA是胃癌的诊断性标志。BSA对乳腺恶性肿瘤阳性率达79%，而对良 性病 变均呈阴性反应，提示BSA可能为乳腺恶性肿瘤的相关标志。凝集素还有助于判别肿瘤的组织类型，如神经系统星形细胞瘤ConA阳性，小胶质细胞瘤阴性，肾腺癌UEA1阴性，透明细胞癌阳性。

三、凝集素在免疫细胞化学中的应用

凝集素可为荧光素、酶和生物素等所标记，分别进行下列染色法：

1．直接法　 标记物直接标记在凝集素上，使之直接与切片中的相应糖蛋白或糖脂相结合。

（1）切片脱蜡至水。

（2）凝集素标记物（100μg/ml），室温，30min。

（3）TBS洗3次，每次2min。

（4）如为荧光素标记物，封片用荧光显微镜观察。如为酶标记物，则应依次进行呈色、脱水、透明和封固后在光学显微下观察。

直接法的优点是简便，目前商品用的凝集素药盒已能购得。但灵敏性不够高。

2．间接法 　将凝集素直接与切片中的相应糖基结合，而将标记物结合在抗凝集素抗体上。

（1）脱蜡至水。

（2）用含3%的H2O2的甲醇阻断内源性过氧化物酶10min。

（3）凝集素稀释液（100μg/ml）孵育30min。

（4）TBS洗3次，每次2min。

（5）用标记了的抗凝集素抗体（1：100）孵育30min。

（6）TBS洗3次，每次2min。

（7）呈色、脱水、透明、封片。