兄弟们谁能告诉我t7rna聚合酶为啥老纯化出来没有活性呢，醉了，纯化工艺需要哪里注意

1、操作尽可能置于冰上或者在冷库内进行。

2、不要太稀

3、合适的pH，除非是进行聚焦层析，所使用的缓冲溶液pH避免与pI相同，防止蛋白质的沉淀。

4、使用蛋白酶抑制剂，防止蛋白酶对目标蛋白的降解；在纯化细胞中的蛋白质时，加入DNA酶，降解DNA，防止DNA对蛋白的污染。

5、避免样品反复冻融和剧烈搅动，以防蛋白质的变性。

6、缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环境。

7、在缓冲溶液中加入0.1~1mmol/LDTT（二硫苏糖醇）(或β-巯基乙醇），防止蛋白质的氧化。

8、加1~10mmol/LEDTA金属螯合剂，防止重金属对目标蛋白的破坏。

9、使用灭菌溶液，防止微生物生长。

在纯化过程中，需要注意以下几点：

选择合适的来源和纯化方法：T7 RNA聚合酶可通过原核表达或真核表达方式获得。在选择来源和纯化方法时，应根据实验需要和实验条件综合考虑。常见的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、尺寸排除层析等。

避免过度稀释：在纯化过程中，应尽量避免过度稀释T7 RNA聚合酶，因为过度稀释可能导致酶活性降低。

避免极端pH值：T7 RNA聚合酶的最适pH范围为7.5-8.5，过高或过低的pH值都可能导致酶的失活。

避免高温和冷冻：T7 RNA聚合酶应保存在-20℃以下的冰箱中，避免高温和冷冻对酶活性的影响。

注意缓冲液的成分和浓度：T7 RNA聚合酶的活性对缓冲液成分和浓度较为敏感，不同的实验条件需要采用不同的缓冲液配方和浓度。

纯化过程中注意温度和ph保持稳定，不然酶容易变性